细胞分子水平基本实验方法举例

第一节　细胞分子水平基本实验方法举例

一、细胞培养概述

1.细胞培养的概念

细胞（组织）培养是指从体内取出组织，或将组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养的条件下，使其生存和生长并维持其结构和功能的方法。

2.细胞培养的主要优点

（1）研究对象是活细胞：在实验过程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期地监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括其形态、结构和生命活动等，特别是可以采用摄影等方法实时记录和观察细胞的变化。

（2）研究条件可以人为控制：进行体外的细胞培养实验时，可以根据需要，通过控制pH值、温度、O₂张力、CO₂张力、离子浓度、渗透压等物理化学条件及其他生物性因素进行实验研究。

（3）样本性状相对均一：通过细胞培养所得到的细胞系属同一类型的细胞，其特性比较均一。特定情况下可采用克隆技术使细胞单一化。

（4）研究内容容易观察、检测和记录：可以通过倒置相差显微镜、电视、电影等直接观察活的细胞；也可采用电子显微镜分析细胞的超微结构；或采用同位素标记、放射免疫等方法检测细胞内物质的合成、代谢的变化等。

（5）研究范围广：可供研究的细胞种类极其广泛，从低等生物到高等动物，以及人类，从胚胎到成体，从正常组织细胞到肿瘤细胞等，都可用于培养。

（6）研究费用相对低廉：细胞培养可以大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，耗资少，比较经济。

当然，细胞培养虽然具有很多优点，但作为一种技术，也有其不足，主要表现为：①体外培养细胞与动物体内的组织细胞相比，虽然在形状、结构和功能上有类似之处，但两者不能完全等同；②培养细胞性状存在不稳定性，尤其是反复传代、长期培养者，有可能发生染色体非二倍体改变等情况；③细胞培养技术对人员、设备等条件都有较高的要求。

3.培养细胞的生长方式及类型

（1）贴附生长型细胞：必须贴附于固相支持物表面才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型（扁平、不规则的多角形，中央有圆形细胞核，细胞紧密相连成单层膜）、成纤维细胞型（细胞呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形细胞核，细胞生长时呈放射状或漩涡状）、游走型细胞（细胞在支持物上散在生长，不连接成片，细胞质常伸出伪足或突起，呈现活跃的游走或变形运动，速度快而不规则）及多形型细胞（没有规律的形态，如神经组织的细胞）等。

（2）悬浮生长型细胞：不需要附着于固相支持物，在悬浮状态下即可生长的细胞（如白细胞）。细胞悬浮生长时，胞体为圆形，不便于在显微镜下观察，但由于是悬浮生长，其生存空间大，容许长时间生长，能繁殖大量细胞，适合于作细胞代谢方面的研究。

4.培养细胞的生长过程

（1）单个细胞的生长过程——细胞周期：细胞周期可分为间期和M期（分裂期）两个阶段。间期分为G1期、S期、G2期。G1期为DNA合成前期（细胞分裂后期），S期即DNA合成期，G2期为DNA合成后期（细胞分裂前期），M期即有丝分裂期。

（2）细胞系的生长过程：在体外培养细胞的全生存过程中，大致经历三个阶段。①原代培养或初代培养期：为新鲜组织自体内取出并接种培养到第一次传代阶段，一般持续1～4周。此阶段的细胞多呈二倍体核型。由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物最好的实验对象。②传代期：原代培养细胞经传代后便改称细胞系（cell line）。传代是原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞融合成片而逐渐铺满固相支持物的表面时，将原代细胞分开接种至2个或多个新的培养器皿中的过程。此期细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。③衰退期：一般情况下，有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞衰退死亡。在以上三个阶段的任何一个阶段（多发生在传代末和衰退期），在某种因素的影响下，细胞可能发生自发性转化，获得永生或恶性化，即细胞获得了持久增殖能力，这种细胞群体称为无限细胞系或连续细胞系。此时细胞转变成异倍体核型。细胞转化亦可采用人工方式诱发，如向细胞系中导入SV40大T抗原就是常用的人工建立永生化细胞系的方法之一。

（3）每代细胞的生长过程：细胞自接种传代至新培养皿中到其下一次再传代接种的时间为细胞的一代。每代细胞的生长过程可分为三个阶段（图21-1）。①潜伏期：当细胞接种入新的培养器皿，不论是何种细胞类型及其原来的形态如何，此时细胞的胞质回缩，胞体均呈圆球形。先悬浮于培养液中，短时间后，那些尚可能存活的细胞，即开始附着于固相支持物，并逐渐伸展，恢复其原来的形态。此时细胞已存活，具有代谢及运动活动，但尚无增殖发生。以后出现细胞分裂并逐渐增多而进入指数生长期。一般细胞潜伏期的时间不长，为24～96h。肿瘤细胞则更短，可少于24h。②指数生长期：此期细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。此期时间的长短因细胞本身特性及培养条件而不完全相同，一般可持续3～5d。③平台期：又称生长停止期。此期可供细胞生长的固相支持物表面已被生长的细胞所占满，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至新的培养器皿并补充新鲜培养液，细胞将于新的培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。若传代不及时，细胞将因代谢产物堆积发生中毒而引起性状改变，甚至脱落、死亡。

图21-1　每代细胞的生长过程中的三个阶段

5.培养细胞的生长条件

体外培养的细胞需要合适的环境和必需的条件才能生存繁殖。

（1）细胞的营养需要：基本营养物质包括氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子等物质。体外培养细胞既需要上述基本营养物质，还需要促细胞生长因子等物质才能正常生长、繁殖。血清中含有多种这类物质，有利于多数细胞的存活和生长。

（2）细胞的生存环境：

①温度：体外培养的细胞需在保持一定恒温的环境中才能生长。哺乳动物包括人类体外培养细胞的理想温度是35～37℃。培养温度如不适当，将会影响细胞的代谢及生长，甚至发生死亡。一般高温比低温对细胞的影响更为明显（图21-2）。

图21-2　温度对细胞生长的影响示意图

②气体条件及pH值：体外培养细胞采用开放培养时，其气体环境一般应为95%空气加5%CO₂的混合气体。CO₂为细胞生长所需要，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的pH值有关。大多数细胞适于在pH值为7.2～7.4条件下生长。一般来说，细胞对酸性培养环境的耐受性强于碱性培养环境，偏酸的条件比偏碱的环境对生长有利。

③无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境。无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。细胞培养中的污染问题包括细菌、支原体、真菌、霉菌等微生物的污染，不同细胞类型的交叉污染及其他有害物质的污染。这些是细胞培养工作中要非常重视的问题。

二、新生大鼠心肌细胞原代培养技术

1.实验前准备工作

（1）70%乙醇500mL，并配制酒精棉球若干。

（2）消毒手术器械一套，包括：眼科剪刀（直、弯）2～3把，镊子（直、弯）3～4把，小（直、弯）钳3～4把。

（3）新生Wistar或SD大鼠（生后1～3d）若干（依据实验设计确定）。

（4）加热式磁力搅拌器一台，温度计一支。100mL烧杯一个，内装40～50mL蒸馏水，置于磁力搅拌器中央，打开磁力搅拌器加热开关，调节水温，并维持在（37±0.5）℃。

（5）已消毒的其他必需品：10mL离心管（螺口者，就用管盖；非螺口者，可用小红帽代之）一盒（20支以上），吸管，6cm培养皿一个，10cm培养皿一个，100mL培养瓶若干，10mL液闪瓶2个（内装1.0～1.5mm磁棒各一支）。

（6）无菌的含10%～15%胎牛血清的DMEM培养基，无钙镁的D-Hanks液，消化液（0.8%～1.2%胰蛋白酶/D-Hanks液），可选加一定浓度的胶原酶。

（7）超净工作台及培养室进行空气消毒，至少开启紫外灯30～60min，随后打开风机开关，并关上紫外灯。

（8）操作人员一人，助手一人，均必须穿戴工作服、帽、手套、培养室用鞋，并用酒精棉球擦手。

2.心肌细胞分离与培养

（1）由助手向10cm培养皿中加入40～50mL 70%乙醇，并将新生大鼠逐个放入培养皿中。

（2）操作员分别打开胰蛋白酶和D-Hanks液瓶盖，6cm培养皿置于超净台中，并向6cm培养皿中加入10mL左右D-Hanks液。拿出弯的眼科剪刀和镊子各一把，搁置于6cm培养皿边缘。

（3）从10cm培养皿中拿出新生大鼠一个，先剪去新生大鼠头部处死，再用拇指及食指抓紧其后颈部皮肤，小指及无名指压住其后肢，中指从其背后略用力上托，使其胸部突出。用酒精棉球擦洗其左胸部2遍。用弯的眼科剪刀小心从胸骨左缘剪开其胸壁，暴露心脏。用弯镊子小心而快速地摘下心脏，置于6cm培养皿中。

（4）取完所有新生鼠心肌后，由助手撤除10cm培养皿及新生大鼠尸体。操作员则立即用直剪、弯镊小心地将心脏周围结缔组织、血管、心房组织剪去，保留心室肌，并将其剪成约1mm³大小，并尽量洗净血凝块。

（5）取一个液闪瓶，用吸管将心肌块吸入液闪瓶中，静置1～2min，吸出D-Hanks液，加入5～8mL（依据心肌组织的多少决定）胰蛋白酶/D-Hanks液，置于调好水温的烧杯中，并打开磁力搅拌器开关，调节速度，不宜过快或过慢。

（6）每隔3～5min或待消化液变浑浊即可吸取1滴消化液滴在载玻片上，显微镜下观察红细胞的大概比例以及有无心肌细胞。如无心肌细胞或红细胞比例仍很高，则弃去所有消化液，重新加入适量的新鲜消化液，继续消化。如此反复3～4次。直到心肌细胞占多数时，即可将消化液吸至10mL无菌离心管中（事先加入2～4mL含15%胎牛血清的DMEM），并重新加入适量消化液继续消化。直到液闪瓶中的心肌组织全部被消化。

（7）将收集在离心管中的心肌细胞悬液离心（600～800r/min，5～6min，4℃），弃上清液后，向每管中加入1～2mL含15%胎牛血清的DMEM，重悬心肌细胞，并转入100mL培养瓶中（3～4管/瓶）。

（8）将100mL培养瓶置于含5%CO₂的37℃培养箱中预培养90～120min（贴壁分离）。

（9）用吸管轻轻吹打心肌细胞使其重悬，并转入一新的无菌培养瓶中，充分悬混后，吸取一滴加入一干净的血细胞计数板中进行计数，调整细胞浓度至1×10⁶/mL。

（10）根据实验需要选择培养瓶的大小，常规接种的细胞数如下：（3.0～4.0）×10⁶（200mL），（1.5～2.0）×10⁶（100mL），（0.5～1.0）×10⁶（50～75mL），（0.1～0.2）×10⁶（25mL）。

（11）每培养24～36h后，换液一次，直至实验结束。

3.注意事项

（1）全程无菌操作。

（2）心脏摘取和心肌组织处理速度要快。

（3）温度控制要严格、准确。

（4）每次消化的时间不能过长，一般以3～5min为宜。

（5）消化液中不能含有钙、镁等二价离子，以免影响胰酶活性。

（6）贴壁分离（预培养）时间不宜过长或过短，一般为1～2h，以达到在提高心肌细胞纯度的同时还能保证心肌细胞的数量。

三、免疫细胞化学——间接免疫荧光技术

1.基本原理

其基本原理是抗原抗体反应，即用特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再用荧光素标记的二抗与上述特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-荧光素标记二抗的复合物。直接采用荧光显微镜观察荧光强度来判定抗原在细胞内的表达。间接免疫荧光法基本上属于定性实验范畴，但由于现代计算机科学的发展，可以设计出荧光强度定量分析软件，而实现使间接免疫荧光法从定性向半定量和定量分析范畴的转变。

2.基本步骤（以贴附型细胞为例）

（1）细胞爬片培养。细胞传代时，将一无菌的载玻片置于合适大小的培养皿中或盖玻片置于6孔培养板中，按一定浓度（依据细胞增殖速度而定，一般为0.2×10⁵/cm²）将细胞接种于玻片上，按实验要求进行培养和处理。

（2）取出玻片，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻漂洗玻片3遍，用4%的多聚甲醛溶液4℃固定30～60min；随后用PBS漂洗细胞3×3min。

（3）必要时可用0.1%Triton-X-100/PBS液处理细胞30min，PBS漂洗细胞3×3 min，吸干水分。

（4）加入2%牛血清白蛋白（BSA）/PBS封闭液于37℃孵育1h。

（5）吸去封闭液，加入适量1∶（200～500）的特异性抗体/BSA/PBS液，37℃孵育1～2h或室温3～5h或4℃过夜（具体孵育时间与抗体的特异性和结合能力有关，需要在实验中摸索）。

（6）弃去特异性抗体溶液，用PBS漂洗细胞3×5min。

（7）加入适量滴度为1∶（200～500）的荧光标记二抗/BSA/PBS液，37℃孵育40min，或室温1h（所需时间仍需在具体实验中摸索）。

（8）弃去二抗溶液，用PBS漂洗细胞3×5min。

（9）复染。可采用0.1%的伊文氏蓝溶液或其他染细胞核的试剂。

（10）弃去复染溶液，PBS漂洗细胞3×5min。

（11）缓冲甘油封片，荧光显微镜观察（图21-3）。

图21-3　间接免疫荧光检测热休克蛋白70（HSP70）在小鼠骨骼肌肌母细胞（C2C12）中的表达，Hoechst进行细胞核染色，Overlay为两者重叠

3.实验对照的设置要求

为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验时设立以下对照实验。

（1）标本自发荧光对照：标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光（无与特异性荧光相似的荧光）。

（2）荧光抗体对照：标本只加荧光标记抗体染色，而不加特异性抗体，结果阴性。

（3）阳性对照：用已知阳性标本作间接免疫荧光染色，结果应呈阳性荧光。

（4）抑制性对照（必要时）：在加荧光标记二抗之前，先用未标记的二抗与特异性抗体处理过的细胞孵育，或是先将荧光标记二抗（低浓度）与未标记二抗（高浓度）混合后，再与特异性抗体处理过的细胞孵育。结果为阴性或明显减弱的荧光。

四、培养细胞核酸（DNA，RNA）提取方法

1.基因组DNA提取方法

（1）试剂：磷酸盐缓冲液（PBS）；细胞裂解液（10mmol/L Tris pH值为7.4，10 mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS）；蛋白酶K溶液（储存液浓度为10 mg/mL，工作液浓度为50～100μg/mL）；Tris饱和酚；氯仿；TE缓冲液；10mg/mL RNase A（无DNase）；3mmol/L醋酸钠，pH值为7.4；80%乙醇。

（2）方法：

①细胞培养与处理：依据实验设计要求培养细胞并进行处理，取生长状态良好的贴壁细胞（＞10⁶），弃培养液，用PBS漂洗2次。

②细胞裂解：加入一定体积的裂解液（以刚刚盖满培养皿表面为宜，亦可先将细胞刮下，离心）；室温裂解约2h，加入适量蛋白酶K（终浓度为50～100μg/mL）。并移入EP管中。

③55～65℃水浴裂解30min或50℃过夜。

④等体积加入1∶1饱和酚/氯仿；用力翻转EP管4～5次，摇动混匀。室温静置2～3min。待肉眼见到分层后，于4℃，12000r/min离心10min。

⑤小心吸取转移上层水相液体入另一干净EP管中，并计算体积。

⑥加入1/10体积的3mmol/L醋酸钠、2.5倍体积的乙醇，用力翻转EP管6～8次，摇动混匀，可见有白色絮状物析出。室温静置15min或-20℃过夜。

⑦4℃，12000r/min离心15min，弃上清。将EP管倒置于干净滤纸上，吸出痕量水分。

⑧加入适量80%乙醇，清洗沉淀物，4℃，12000r/min离心5min，弃上清，重复洗涤一次。

⑨将EP管倒置于干净滤纸上，吸出痕量水分（空气干燥），静置10～15min，加入适量TE缓冲液溶解沉淀。

⑩加入终浓度为20μg/mL的RNase A，37℃孵育30min。重复步骤④～⑨。待完全溶解后，测量260nm吸光值定量DNA浓度。-80℃保存或直接用于实验。

（3）注意事项：①避免培养基中血清对蛋白酶K活性的影响，应该漂洗细胞至少两次，以去除残留的血清；②避免RNA的污染，要使用RNase A；③实验用器材要干净，避免DNase A污染，降解DNA；④定量前可通过降低DNA浓度和37℃振荡过夜确保DNA完全溶解；⑤注意自我保护，酚和氯仿是具有强腐蚀性和毒性的化学试剂，操作时要注意防护。

2.总RNA提取方法（Trizol提取法）

（1）试剂：Trizol试剂；RNA提取专用氯仿、异丙醇；DEPC处理水配制的75%乙醇、PBS缓冲液；无RNase的去离子水；其他RNA提取所需器材（如EP管、试管、吸头等均需经DEPC处理并消毒，或直接购买用于RNA抽提的一次性耗材）。

（2）方法：

①细胞培养和处理：同DNA提取。

②细胞裂解：用PBS漂洗细胞两次，室温下加入适量Trizol试剂（1mL/10cm²），用加样枪反复多次吸打细胞，室温下放置10～30min或间隔一定时间再次吸打，以便细胞充分裂解。

③加入0.2mL氯仿/1mL Trizol，用力多次翻转EP管或震荡混合（剧烈）15s，室温静置2～3min。待肉眼见到分层后，于4℃，12000g离心15min。

④小心吸取转移上层水相液体入另一干净EP管中，并计算体积。

⑤加入0.5mL 100%异丙醇/1mL Trizol，轻轻翻转EP管3～5次，室温静置10min。

⑥4℃，12000r/min离心10min，弃上清液。将EP管倒置于干净滤纸上，吸出痕量水分。

⑦加入1mL 75%乙醇，清洗沉淀物，4℃，7500r/min离心5min，弃上清，重复洗涤一次。

⑧同DNA提取方法步骤⑨进行真空或空气干燥10～15min。

⑨加入适量无RNase的去离子水溶解RNA，并用加样枪反复吸打，或55～60℃水浴10～15min以确保RNA溶解。

⑩测量260nm吸光值定量RNA浓度。-80℃保存或直接用于实验。

（3）注意事项：基本同DNA提取方法的注意事项，同时更要注意所有试剂和器材都需要经过去除RNase处理，防止RNA降解。

五、培养细胞蛋白质提取、蛋白质浓度测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹技术

1.基本原理

（1）蛋白质定量（考马斯亮蓝测定法）基本原理：考马斯亮蓝G250在游离状态下呈红色，在酸性溶液（磷酸）中与蛋白质分子中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液的颜色由棕色变为蓝色。在特定蛋白质浓度范围内（0～1000μg/mL），蛋白质-G250复合物在595nm处的吸光值与蛋白含量成正比。

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基本原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N’_-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺（TEMED）的作用下，聚合交联而形成具有网状立体结构的凝胶。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷，带负电荷的多少仅与蛋白质氨基酸残基的数量有关（肽段的长短），而与原有电荷和分子形状无关。带负电荷的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶网状结构中，在电场的作用下产生“分子筛”效应，并向正极移动，其迁移速率和距离随蛋白质分子所带电荷的差异以及蛋白质分子的大小不同而不同，在凝胶上得以分离并形成若干条区带。

（3）免疫印迹的基本原理：利用电场的作用将凝胶上的多肽从SDS-PAGE转移至一种固相支持物上（如硝酸纤维素膜、PVDF膜等），再依据抗原抗体反应原理，用目的蛋白质的特异性抗体检测目的蛋白质（抗原）。

2.主要试剂和器材

RIPA裂解液（0.5mol/L Tris-HCl pH值7.5，150mmol/L NaCl，1%NP40，0.5%去氧胆酸钠，0.1%SDS）；PMSF以及蛋白酶抑制剂混合物；考马斯亮蓝溶液（0.1 mg/mL考马斯亮蓝G250，5%乙醇，10%磷酸）；白蛋白标准液（0.5mg/mL）；磷酸盐缓冲液；0.5%NaCl溶液；30%丙烯酰胺（29.2/0.8g）；10%SDS；Tris-HCl（pH值6.8和pH值8.8两种）；TEMED；10%过硫酸铵；10×电泳缓冲液（30.3g Tris碱，144g甘氨酸）；1×转膜液（5.52g Tris-HCl，2.93g甘氨酸，20%甲醇，10%SDS 3.75mL/L）；10×TBS缓冲液（24.2g Tris碱，80g/L NaCl，pH 7.6）；1×TBST（1×TBS，0.1% Tween 20）；β^-巯基乙醇；1×Laemmli样品缓冲液（62.5mmol/L Tris-HCl，pH值6.8，2%SDS，25%甘油，0.01%溴酚蓝）；5%脱脂奶粉或2%的BSA/TBS溶液；一抗与二抗-BSA/TBS溶液；DAB显色试剂盒或ECL发光检测试剂盒；电泳槽与转膜槽（图21-4），电泳、转膜两用仪（图21-5）及其相关装置；滤纸；硝酸纤维素膜或PVDF膜；电动水平摇床；离心机等。

图21-4　电泳槽与转膜槽及其相关组件示意图

注：（a）为电泳槽及其组件；（b）为转膜槽及其组件。

图21-5　电泳、转膜两用仪

3.基本步骤

（1）细胞总蛋白的提取：

①细胞培养与处理：依据实验设计要求培养细胞并进行处理，取生长状态良好的贴壁细胞（＞10⁶），弃培养液，用PBS漂洗2次，或用细胞刮子直接在原培养液中刮下细胞，收集细胞悬液，1000r/min离心8min。用适量PBS洗涤细胞并离心两次，收集细胞沉淀。

②将适量蛋白酶抑制剂混合物和PMSF加入RIPA裂解液，并置于冰上预冷。用适量PBS重悬细胞沉淀，加入适量预冷的RIPA裂解液混合物。4℃裂解30min，或冻融3次。

③4℃12000r/min离心10min，收集蛋白上清液，并转移至另一干净的EP管中。

（2）细胞总蛋白浓度测定（考马斯亮蓝法）：

①将4mL考马斯亮蓝/磷酸染液加入1mL白蛋白标准液与0.5%NaCl溶液的混合液中（用0.5%白蛋白标准液制备0～100mg范围蛋白，并用0.5%NaCl溶液补齐至1mL）。

②配制蛋白质样品与考马斯亮蓝/磷酸染液混合液：5μL蛋白质样品、995μL0.5% NaCl溶液以及4mL考马斯亮蓝/磷酸染液。

③混匀后，紫外可见分光光度计测A595吸光值。

④利用白蛋白标准液吸光值绘制标准曲线及回归方程参数。

⑤利用蛋白质样品A595吸光值，并根据曲线回归方程，依次计算出每个样本的蛋白浓度。

⑥标记并记录各蛋白质样品浓度后，分装，-80℃保存备用。

（3）SDS-PAGE。

①制备SDS-PAGE：SDS-PAGE分为两部分，即低浓度（通常为5%）的浓缩胶和较高浓度（通常8%～16%）的分离胶。分离胶浓度的选择依赖于待检测目的蛋白的相对分子质量，如果目的蛋白相对分子质量大于100kDa，则可选用等于或低于10%的分离胶；反之，则可选用高于10%的分离胶。总之，相对分子质量大选择低浓度胶（分子筛孔径大），相对分子质量小选择高浓度胶（分子筛孔径小）。a.10%分离胶的制备（10mL）：在15mL试管中，顺序加入30%聚丙烯酰胺溶液3.3mL、1.5mol/L Tris-HCl（pH值8.8）2.5mL、ddH2O4.0mL、10%SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 6μL，混匀；立即注入事先装配好的玻璃板的间隙中，并控制好灌注高度，留有足够空间以制备浓缩胶。加入1mL双蒸水或异丙醇进行封闭，以隔离空气。室温下静置30min。当水封层与分离胶层之间出现明显界面时，表示分离胶的聚合已完成。b.5%浓缩胶的制备：除去分离胶水封层并用滤纸吸干，将样品梳固定于长形玻璃板上端。在10mL试管中，依次加入30%聚丙烯酰胺溶液1.0mL、1mol/L Tris-HCl（pH值6.8）0.75mL、ddH2O 4.1 mL、10%SDS 0.06mL、10%过硫酸铵0.06mL、TEMED6μL，混匀，将配制好的浓缩胶缓缓注入凝胶腔内，至样品梳齿槽内的空隙填满，室温静置45min。轻轻快速拔掉样品梳，将模具安装在电泳架上，并加入适量1×电泳缓冲液，准备上样电泳。

②蛋白样品的处理：蛋白样品15μL（2～4μg/μL，以最低样品浓度为准），β^-巯基乙醇2μL，1×Laemmli样品缓冲液（15μL），双蒸水补齐至总体积40μL（具体体积由各实验者自己设定）；100℃煮沸蛋白样品混合液5～10min。

③上样、电泳：每泳道，上样总体积为40μL，上样量30～60μg，保证每泳道上样总体积和蛋白总量相等。上样体积由实验者自己根据实际情况决定。接通电源，低电压（70V左右）稳压电泳1h左右，转换成高电压（120V左右）稳压电泳3～4h，待溴酚蓝指示剂迁移到分离胶下游边缘时（可依据目的蛋白质的相对分子质量大小调整），停止电泳。

（4）电转膜（湿转法）：取适当大小的PVDF膜或硝酸纤维素膜（依据实验者全胶转移或部分胶转移的需要进行裁剪，以达到节约的目的）。PVDF膜需经甲醇预浸泡处理，并与分离胶一起用转移缓冲液平衡15～20min，依照夹心法原则依次将滤纸、膜、凝胶、滤纸顺序叠放好，并小心除去膜和胶夹心内的气泡。用带合适厚度海绵的夹槽夹好后置于转膜槽中，加入适量1×转移缓冲液。接通电源，150～300mA（由电泳仪最高输出电流决定）4℃稳流电泳3～4h（时间依据目的蛋白质相对分子质量大小可以适当延长或缩短），或低电流4℃过夜。

（5）免疫印迹。

①非特异性封闭：将硝酸纤维素膜置于适量5%脱脂奶粉/TBS或2%BSA/TBS封闭液中（注意膜的方向和正反）。室温封闭2h或4℃过夜。置于电动摇床上，适量TBST漂洗3×5min。

②特异性一抗结合反应：用5%脱脂奶粉或2%的BSA/TBS液稀释特异性一抗（1∶1000）（稀释比例依据产品说明以及抗体的特异性进行）。室温孵育2h或4℃过夜，TBST漂洗3×10min。

③二抗结合反应：用5%脱脂奶粉或2%的BSA/TBS液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3000～5000）。室温孵育1h，TBST漂洗3×10min。

④底物显色：DAB或ECL法，依据产品说明书进行。采用DAB法时，一旦肉眼看见有色条带，立即弃去显色液，并将膜转移至含过量蒸馏水的容器中，室温放置20h，将膜取出置于滤纸上，吸干水分，拍照保存（图21-6）。

图21-6　免疫印迹检测HSP70在C₂C₁₂肌原细胞中的表达

注：DAB显色法，蓝色条带为预染的蛋白质相对分子质量标志物。

（6）蛋白条带灰度扫描及数据处理：实验所得免疫印迹条带，经拍照后，采用灰度分析软件（如Bandscan）分析各条带的灰度值，并经β^-actin等看家蛋白灰度值校正后进行定量比较分析。