人体形态学的研究技术

四、人体形态学的研究技术

（一）大体形态学的研究技术

1．人体标本制作技术　为了学习和研究正常人体的形态结构，需要把人的遗体制作成示教标本和陈列标本。首先要进行固定，常用的固定液为10%甲醛（福尔马林）溶液，经血管灌注后，把标本浸泡在10%甲醛溶液中长期保存。在标本上正确暴露各种器官、组织的形态结构，如神经、血管、肌肉、心、肝等，能使学习者正确掌握人体的形态结构；制作好的解剖标本，可作为临床应用，特别是为外科手术提供直观的参考依据；通过标本制作可以发现形态结构的异常，如血管、神经的变异和器官畸形等。

2．管道铸型技术　管道铸型技术是解剖学标本制作的一项专门技术，在医学教学和显微外科中有很高的应用价值。铸型标本的制作原理与工业上常用的浇铸工艺一样，以人体内的管道（如血管、支气管、肝管、胰管等）作模具，将填充剂（高分子化合物）用注射器灌注到管道内，待管道内的填充剂硬化后，再利用高分子化合物耐酸、耐碱的特性，用酸或碱将其他组织腐蚀掉，留下的就是管道的铸型。利用此项技术可以制作脑室、内耳以及内脏器官管道（如动脉、静脉、淋巴管、外分泌管等）铸型标本，用于研究器官的内部立体构筑。

3．尸体解剖　尸体解剖是对人体进行大体形态结构研究的最直接手段。对病死者遗体进行病理剖检不仅可以直接观察疾病的病理改变、明确诊断、查明死因，以提高临床医疗的质量，而且可以积累资料，为深入研究人体形态结构和人类疾病做出重要贡献。

4．生物塑化技术　生物塑化是一种可以把组织保存得像活体一样的特殊技术。它通过一种真空过程，用硅橡胶、环氧树脂等活性高分子多聚物对生物标本进行渗透，所用多聚物的种类，决定了浸透标本的光学性能（透明或不透明）和机械性能（柔软和坚韧）。塑化技术可以使标本的表面保持其原有的状态，并可在显微镜水平保存细胞的结构。塑化标本干燥、无味、耐用、易长久保存，广泛应用于解剖学、生物学、组织学、胚胎学、病理学、法学等学科和领域。

（二）显微形态学的研究技术

1．普通光学显微镜术　应用普通光学显微镜（简称光镜）观察人体微细结构是显微形态学研究的最基本方法。通常光镜可放大1500倍，分辨率为0．2μm。石蜡切片术是经典常用的技术，其基本过程包括取材、固定、脱水透明、包埋、切片、染色等主要步骤。将包埋有组织的蜡块用切片机切成5～10μm的薄片，贴于载玻片上。切片经脱蜡、染色、透明、封固后便可在镜下观察，所见结构称光镜结构。最常用的染色方法是苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色，简称HE染色。

苏木精是碱性染料，可使细胞核以及细胞质内的核糖体染成紫蓝色；伊红是酸性染料，可使细胞质以及细胞外基质中的成分染成粉红色。对碱性染料亲和力强的称嗜碱性（baso‐philia），对酸性染料亲和力强的称嗜酸性（acidophilia），对碱性染料和酸性染料亲和力都不强的称中性（neutrophilia）。

除HE染色外，还有多种染色方法，能特异性地显示细胞、细胞内的某些结构、细胞外基质中的某种成分。例如，有的细胞经重铬酸盐处理后呈棕褐色，称嗜铬性（chromaffinity）；有的细胞或组织成分经硝酸银处理后呈棕黑色，称亲银性（argentaffin）；有些组织结构本身不能使硝酸银还原，需加还原剂才能显色的现象称嗜银性（argyrophilia）；肥大细胞的颗粒可被甲苯胺蓝等碱性染料染色后呈紫红色，称异染性（metachromasia）。

为了更好地保存细胞内酶的活性或缩短切片制作过程，新鲜的组织块也可不予固定，立即投入液氮（－196℃）内快速冻结，用恒冷箱切片机制成冷冻切片，再通过染色立即观察。临床上常用于手术时良恶性肿瘤的快速病理诊断。此外，血细胞、分离细胞或脱落细胞可直接涂在玻片上（涂片），疏松结缔组织可撕成薄片铺在玻片上（铺片），牙和骨等坚硬组织可磨成薄片（磨片），再经固定、染色后在镜下观察。

在细胞培养术中，普通光镜不易分辨无色透明的活细胞，需用相差显微镜来观察。在组织化学术中，常使用荧光染料染色或作为标记物，用荧光显微镜观察。近年应用的激光扫描共聚焦显微镜，是在荧光显微镜的基础上加装激光共轭聚焦逐层扫描装置，利用计算机进行图像处理，获得细胞核组织内部微细结构的荧光图像，观察细胞形态和细胞内的微细结构及其变化，可动态检测细胞内各种离子、pH、膜电位等生理信号。

3．电子显微镜术　1932年，M．Knoll和Ruske发明了电子显微镜（electron micro‐scope，EM），简称电镜。电镜可放大几万倍到几十万倍，分辨率可达0．2nm，能观察到细胞更细微的结构。在电镜下的结构称超微结构（ultrastructure）。

在光镜和电镜下进行观察，常用的长度计量单位为毫米（mm）、微米（μm）、纳米（nm），这些单位间的关系如下：

1mm＝1000μm

1μm＝1000nm

（1）透射电子显微镜术　透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）技术的组织须用戊二醛和锇酸固定，树脂包埋，超薄切片（厚50～80nm）经铅盐等重金属盐染色后，在透射电子显微镜下观察。被金属所染部位荧光屏上显得暗，图像较黑，称为电子密度高；相反，则称为电子密度低。

（2）扫描电子显微镜术　扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）技术用于观察组织或细胞表面的超微结构，标本不需制成切片，经固定后，在其表面喷镀金，然后在扫描电子显微镜下观察，在荧光屏上扫描成像，呈现富有立体感的表面图像，如细胞表面的微绒毛、纤毛和细胞表面突起等。

4．组织化学术　组织化学（histochemistry）方法是利用化学试剂与组织、细胞内的某些物质发生化学反应，在局部形成有色沉淀物，通过显微镜观察对组织、细胞内的化学成分进行定位、定性和定量的研究。

（1）过碘酸雪夫反应（periodic acid‐Schiff reaction，PAS）　是显示细胞内糖原、多糖或蛋白多糖的一种方法。PAS阳性部位为多糖存在的部位。

（2）脂溶性染料显示脂类　脂类物质包括脂肪和类脂。标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹类染料染色，使组织和细胞中的脂类物质显示相应颜色。亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。

（3）酶细胞化学染色　各种不同的酶有不同显示方法。一般来说，是将组织切片在某些特异性底物的溶液中温育，而后检出反应产物，它再和某种捕获剂结合形成有色的沉淀物，即可知酶的存在。如显示腺苷三磷酸酶，作用液中就含三磷酸腺苷。然后再把被酶分解的某一成分与另一物质结合，呈现具有一定颜色的沉淀物，借此可在显微镜下观察酶的活性强弱、存在部位等。

（4）福尔根反应（Feulgen reaction）　是显示DNA的传统方法，其原理是组织经盐酸水解后，打开了DNA分子中的脱氧核糖和嘌呤碱基之间的连接键，从而暴露出了脱氧核糖中的醛基，醛基与Schiff试剂作用，原理同PAS反应，使细胞核DNA呈紫红色。亦可用甲基绿派若宁反应，同时显示DNA（蓝绿色）和RNA（红色）。

5．免疫组织化学术（immunohistochemistry）　主要是利用抗原与抗体特异性结合的原理，检测组织或细胞中的多肽和蛋白质等大分子。先将这种蛋白质（或多肽）作为抗原，注入某种动物体内，使其体内产生与所注入抗原相应的抗体；将抗体从该动物血清中提取，并以辣根过氧化物酶、铁蛋白、荧光染料等标记，将标记后的抗体滴在切片组织上，与切片组织上相应抗原特异性结合。所以切片中有标记物呈现，从而显示该物质在组织中的分布。抗体若用辣根过氧化物酶标记，再通过对此酶的组织化学显示处理，可在光镜下观察到；若用铁蛋白标记，可在电镜下观察到；若用荧光染料标记，则可在荧光显微镜下观察到。

用标记抗体检测抗原的方法有两种，即直接法和间接法。直接法是以荧光素或酶标记的抗体浸染被检测的样品来检测标本内抗原成分，所以又称一步法。该法简单，特异性强，但敏感度不如间接法。间接法需要两种抗体参与反应，所以又称二步法。先将第一抗体（简称一抗）作为抗原免疫另一动物，制备一抗的抗体，即第二抗体（简称二抗），用荧光素或辣根过氧化物酶等标记二抗，先后以一抗和标记二抗处理切片标本，最终形成抗原一抗标记二抗复合物。间接法是一个抗原分子通过一抗与多个标记二抗结合，使抗原更清晰显示，因此敏感性较高。

6．原位杂交术（in situ hybridization）　是利用核酸分子杂交技术，目前这种技术广泛地用来检测基因片段的有无，以及在转录水平基因（mRNA）的活性。其原理是使用带有标记物的已知碱基顺序的核酸探针（标记的RNA和DNA探针），与细胞内待测的DNA和RNA形成特定的双链分子，即杂交，然后通过对标记物的显示和检测，获知待测核酸的有无及含量。目前常用的标记物如地高辛等。

7．体外培养技术（in vitro culture）　将机体的活细胞、活组织置于培养基中培养，必须具备适宜的条件，如营养、氧气、二氧化碳、适度的渗透压、pH值、温度和湿度。体外培养技术可以观察各种物理、化学和生物因素对组织或细胞的作用，探索和提示细胞生命活动规律和细胞的结构功能变化。