细胞化学染色检查

第二节　细胞化学染色检查

细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学，它以细胞形态为基础，结合运用化学反应的原理对细胞内的各种化学物质（酶类、糖、铁、蛋白质、核酸等）做定性、定位、半定量的分析。

细胞化学染色在临床上用于：推断细胞的来源系列，借以分类白血病；病理情况下某种细胞的化学成分的含量改变，如感染情况下粒细胞的碱性磷酸酶升高，慢性粒细胞性白血病是减低等；观察疾病的治疗疗效及探讨发病机理，不同的细胞化学染色，染色步骤不同，但基本步骤如细胞的固定、显示、复染步骤相同。

1.固定　为了保持细胞的原有结构及形态及化学物质的不变，需要对细胞进行固定。选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、酶类、糖类等物质变为不溶性物质。固定方法有物理的和化学的，临床上一般用化学法固定。物理法包括：干燥、火焰固定。化学法包括甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等。

（1）蒸汽固定：甲醛是一种常用的固定剂，甲醛极易挥发、氧化，故用40%的甲醛溶液在密闭的容器里血膜朝下5～10分钟，备用。

（2）液体固定：将涂片浸在如甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等溶液里3～5分钟，用蒸馏水冲洗，备用。

2.显示　显示的过程就是用化学染色剂通过化学反应，最终在细胞体内外形成稳定的有色显像的过程，通常有偶氮偶联法、联苯胺兰法、普鲁士兰法、雪夫氏反应及金属沉淀法。

（1）偶氮偶联法：用含萘酚的底物，在相应的条件下释放出萘酚，萘酚于重氮盐结合，偶氮偶联出有色沉淀。重氮盐有：坚固紫蓝酱、坚固蓝B、六偶氮付品红等。如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、酸性磷酸酶染色等。

（2）联苯胺蓝染色：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶，能分解氧化物氢释放出新生态氧，使无色的联苯胺氧化为有色的沉淀，如过氧化物染色。

（3）普鲁士兰反应：细胞内或外的铁与酸性亚铁氰化钾作用，生成亚铁氰化钾蓝色的沉淀，颜色如孔雀蓝色。

（4）雪夫氏反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇醛酸，醛基与雪夫氏作用，使无色的品红生成红色沉淀物。

（5）金属沉淀法：金属及金属化合物一般都有颜色，故形成的沉淀物为有色物质，如钙-钴法中性粒细胞碱性磷酸酶染色。

3.复染　复染的目的在于使各种细胞以及细胞的不同部位能显示出来，便于细致观察。选择复染物的颜色应与有色沉淀的颜色有鲜明的对比，既能显示细胞的结构又能显示细胞的化学染色。如铁染色常用中性红，过碘雪夫氏反应常用甲基绿。对细胞核着色较好的有中性红、甲基绿、苏木精、坚固红、沙黄等。使将着色较好的有伊红、刚果红、光绿等。

由于细胞化学染色试剂实行规范化，均使用标准试剂盒故这里只介绍各种细胞化学染色的原理、染色结果及临床意义。

一、过氧化物酶染色

【原理】过氧化物酶（POX）染色是粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒含有过氧化物酶能释放新生态的氧（H₂O₂）能使四甲苯胺氧化成为蓝色联苯胺蓝（或者与亚铁氰化钠结合生成蓝色的物质）沉淀于细胞之内。

【正常血细胞的染色反应】

1.粒细胞系统　分化差的原始粒细胞为阴性；分化好的原始粒细胞至中性成熟粒细胞为阳性，随着细胞的成熟阳性反应逐渐增强；中性分叶核成熟粒细胞为强中性分叶核成熟粒细胞为强阳性，但衰老的中性分叶核成熟粒细胞阳性程度减弱至阴性；嗜酸性粒细胞阳性最强，其阳性颗粒最大、有折光性；嗜碱性粒细胞单核细胞系统多为阴性。

2.多数单核细胞系统的细胞呈阴性或弱阳性，阳性颗粒少而细小。

3.其他细胞　淋巴系统、红细胞系统及巨核细胞系统均阴性；浆细胞及组织细胞呈阴性、吞噬细胞有的呈阳性。

【临床意义】

过氧化物酶（POX）染色是辅助判断急性白血病细胞类型的首选、最重要的细胞化学染色。在观察细胞的POX染色前要注意成熟粒细胞是否呈为强阳性，以判断POX染色成功与否。

1.帮助鉴别急性白血病的类型

（1）急性粒细胞性白血病，原始粒细胞为阳性，阳性颗粒较多、较粗大、常显局限性分布，但阴性是也不能排除本病；急性淋巴细胞性白血病时，原始淋巴细胞和幼淋巴细胞均阴性，但少数为阳性细胞，有人认为此为原粒细胞，故FAB分型规定急性淋巴细胞性白血病其阳性率小于3%，急性单核细胞性白血病，原始单核细胞为阴性，少数细胞弱阳性，但阳性颗粒细小且弥漫分布。

（2）小型原始粒细胞和原始淋巴细胞不易区别，如果小型原始细胞呈POX染色阳性反应，可确定为小型原始粒细胞。

（3）急性早幼粒细胞性白血病有时需与急性单核细胞性白血病鉴别。如果白血病细胞呈过氧化物酶强阳性反应，应确定为急性早幼粒细胞性白血病。

（4）急性单核细胞白血病有时需与组织细胞白血病和恶性组织细胞病相鉴别，组织细胞白血病和恶性组织细胞病细胞呈阴性反应，白血病幼单核细胞呈弱阳性反应。

2.成熟中性粒细胞POX染色变化

（1）活性增高：可见于再生障碍性贫血、感染、急性淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。

（2）活性减低：可见于急性粒细胞性白血病，慢性粒细胞性白血病，急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、放射病和退化的中性粒细胞。

二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色

【原理】中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色方法有Gomori钙钴法和Kaplow偶氮偶联法，因为钙钴法操作较为复杂故多采用Kaplow偶氮偶联法，其原理为：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在pH9.6碱性环境中，能水解基质中的磷酸奈酚钠底物，释放出奈酚与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶的所在处。

【正常血细胞的染色反应】

1.NAP　主要存在于中性粒细胞（包括杆状和分叶核中性粒细胞中），呈阳性反应，其他细胞基本为阴性。

2.成熟中性粒细胞碱性磷酸酶积分计算在油镜下，计数100个成熟中性粒细胞和杆状核中性粒细胞，分别记录积分0分、1分、2分、3分、4分，计算阳性细胞的阳性总分值。

【参考值】NAP积分正常值35～70分。

【临床意义】

1.生理性变化

（1）年龄变化：新生儿NAP活性增加，以后下降。儿童各年龄大致相似，成人较儿童活性减低，老年期更低。

（2）应急状态下变化：紧张、恐怖、激烈运动等NAP活性增加。

（3）月经周期中的变化：经前期增高，行经后降低，经后期恢复。

（4）妊娠期变化：妊娠2-3个月的NAP活性轻度增高，以后逐月增高，分娩时最高，产后恢复正常。

2.病理性变化

（1）NAP积分增加：见于细菌感染、再生障碍性贫血、某些骨髓增殖性疾（慢性粒细胞性白血病的急变期、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症）急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、恶性淋巴瘤、骨髓转移癌、肾上腺糖皮质激素及雄性激素治疗后。

（2）NAP积分下降：慢性粒细胞白血病（慢性期），阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓增生异常综合征、恶性组织细胞病等。

三、过碘雪-夫氏反应

【原理】过碘酸是氧化剂，使还有乙二醇基（-CH0H- CH0H）的多糖类物质（糖原、黏多糖、粘蛋白、糖蛋白及酯糖）氧化，形成双醛基（-CH0- CH0）。醛基与过碘雪-夫氏试剂中的无色品红结合，生成紫红色化合物，定位于含有多糖类的细胞内。

【正常细胞的染色反应】

1.粒细胞系统　分化差的原始粒细胞为阴性，分化好的原始粒细胞至中性分叶核粒细胞为阳性并随着细胞的成熟度而增强；嗜酸性粒细胞的是酸性颗粒不着色，而颗粒间的胞质呈红色；嗜碱性粒细胞颗粒呈阳性，而颗粒之间胞质不着色。

2.红细胞系统　幼红细胞及红细胞为阴性。

3.单核细胞系统　分化差的原单核细胞为阴性，其他为阳性，其阳性颗粒为呈系颗粒状，有时分布在细胞边缘的阳性颗粒较大。

4.淋巴细胞系统　大多数淋巴细胞系统的细胞为阴性，少数淋巴细胞为阳性，阳性颗粒呈块状或粗颗粒状。

5.巨核细胞系统　巨核细胞系统的细胞包括血小板为阳性，阳性颗粒呈块状或粗颗粒状。

6.其他细胞　浆细胞为阴性，少数为阳性，阳性颗粒呈细颗粒状；巨噬细胞为阳性呈细颗粒状。

【临床意义】

1.红细胞系统疾病　红血病、红白血病、骨髓增生异常综合征中幼红细胞可为阳性（呈均匀的块状），有时幼红细胞阳性反应强，甚至红细胞也为阳性。在某些红细胞性疾病如：缺铁性贫血、地中海性贫血中幼红细胞也可为阳性，且阳性率较高。巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等中幼红细胞也可为阴性，有时个别细胞为阳性。

2.白细胞系统　主要用于鉴别急性白血病的类型作用，因为不同细胞类型的急性白血病其阳性反应可不同，急性淋巴细胞白血病时原淋及幼淋巴细胞的阳性率升高，呈颗粒状或块状；急性粒细胞白血病时少数原粒细胞呈阳性，阳性呈细颗粒或均匀的红色；急性单核细胞白血病时原单核细胞和幼单核细胞可呈阳性，阳性呈细颗粒弥漫分布，有时胞质边缘处颗粒较粗大。慢性淋巴细胞白血病的阳性率升高，呈粗颗粒或块状；恶性淋巴瘤时淋巴瘤细胞的阳性率升高，呈粗颗粒或块状。

3.其他细胞　戈-歇氏病细胞呈强阳性，尼曼-匹克细胞呈阴性或阳性；巨核细胞呈阳性，Reed-sternberg细胞呈阴性或阳性；骨髓转移癌的腺癌细胞呈强阳性。

四、铁染色

【原理】正常人的骨髓中的铁储存主要是存在于骨髓小粒和幼红细胞中，骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，生成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁部位。

【正常血细胞的染色反应】骨髓中的储存铁分为细胞内铁和细胞外铁。细胞外铁主要分布骨髓小粒的巨噬细胞内，细胞内铁是指储存在中幼红细胞、晚幼红细胞及成熟红细胞的铁（包括铁粒幼红细胞、环形铁粒幼红细胞及铁粒红细胞）。

1.细胞外铁　根据观察骨髓小粒中的铁蓝色呈:无、弥漫状、颗粒状、小珠状、块状判断为（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。

2.细胞内铁　观察100个中幼及晚幼红细胞，计算出铁粒幼红细胞的百分比。铁粒幼红细胞是指胞质中出现蓝色颗粒的幼红细胞，根据蓝色颗粒的多少及粗细分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型及环形铁粒幼红细胞。环形铁粒幼红细胞是指幼红细胞胞质中蓝色颗粒在6颗以上环绕核周1/2以上者。成熟红细胞中出现铁颗粒为铁粒红细胞。

【参考值】

1.细胞外铁　（+）～（++）约2/3的人（++），约1/3的人为（+）。

2.细胞内铁　铁粒幼红细胞阳性率19%-44%，以Ⅰ型为主，少数为Ⅱ型，无环形铁粒幼红细胞及铁粒红细胞。

【临床意义】铁染色是临床应用广泛的细胞化学染色之一，由于易铁污染，故化学试剂和试验用器作重处理。

1.缺铁性贫血　细胞内外铁明显减低或为无，因此铁染色是诊断本病的重要依据。

2.铁粒幼细胞贫血　铁粒幼细胞增多，其中的环形铁粒幼细胞增多，有时可见到铁粒红细胞，细胞外铁明显增多。

3.骨髓增生异常综合征　伴环形铁粒幼红细胞增多的难治性贫血，其环形铁粒幼红细胞大于15%，细胞外铁也增加。

4.非缺铁性贫血　溶血性贫血、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血、多次输血后和白血病等细胞内外铁正常或增加；感染、肝硬化、慢性肾炎、尿毒症、血色病等细胞外铁明显增加而铁粒幼红细胞减少。

五、酸性磷酸酶染色

【原理】酸性磷酸酶（ACP）存在于细胞的溶酶体的颗粒中，有的细胞中酸性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及鉴别诊断。染色方法有偶氮偶联法和Gomori硫化钴法，以前者常用，两种方法原理如下：

偶氮偶联法：血细胞中的酸性磷酸酶在酸性（pH5.0）条件下，能水解基质中的磷酸奈酚AS-BI，释放出奈酚AS-BI与基质液中的重氮盐偶联，形成不溶性有色沉淀，定位于胞质中。本实验用的重氮盐为六偶氮付品红，故沉淀为红色。

抗酒石酸酸性磷酸酶染色：用相同的方法制备二份基质液，一份加入L-酒石酸，另一份不加。取两张标本涂片，分别用不同的基质液作酸性磷酸酶染色，如果血细胞内的酸性磷酸酶耐L-酒石酸，两张标本涂片均阳性；如不耐L-酒石酸，不加L-酒石酸者阳性，加L-酒石酸者阴性反应。

【正常血细胞的染色反应】 粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞呈阳性。

【临床意义】

临床酸性磷酸酶（ACP）染色应用较少，主要用于多毛细胞白血病的诊断和脂质代谢障碍性疾病的鉴别。

1.多毛细胞白血病　毛细胞呈强阳性，阳性反应不被L-酒石酸抑制。慢性淋巴细胞型白血病的淋巴细胞和恶性淋巴瘤ACP染色也为阳性，但可被L-酒石酸抑制呈阴性。

2.鉴别戈-谢氏细胞和尼曼-匹克细胞戈-谢氏细胞为阳性，尼曼-匹克细胞阴性。

3.鉴别T淋巴细胞B淋巴细胞　T淋巴细胞为阳性，B淋巴细胞阴性。

六、α-醋酸奈酚酯酶染色

【原理】血细胞内的、α-醋酸奈酚酯酶（α-NAE）在PH中性条件下水解基质溶液中的α-醋酸奈酚，释放出α-奈酚，进而与基质中的重氮盐偶联，生成有色沉淀物，定位于细胞质含此酶的部位。本实验用重氮盐为坚牢蓝B，故沉淀为棕黑色或灰黑色。

【正常细胞的染色反应】

1.单核细胞系统　分化差的原单核细胞为阴性，分化好的原单核细胞为强阳性，幼单核细胞和成熟单核细胞为阳性，单核系细胞的阳性反应可被氟化钠抑制，所谓抑制是指氟化钠实验的抑制率大于50%，抑制率的计算公式为：

氟化钠抑制率=[（抑制前阳性率－抑制后阳性率）/抑制前阳性率]×100%

2.粒细胞系统　各期粒细胞多为阴性，有时少数粒细胞为弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。

3.淋巴细胞系统　各期淋巴细胞多为阴性，少数淋巴细胞为弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。

4.其他细胞　巨核细胞和血小板为阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。幼红细胞多为阳性，少数幼红细胞为弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。浆细胞为阴性。

【临床意义】

α-醋酸奈酚酯酶染色为一种非特异性酯酶染色，是急性白血病鉴别的常用染色。

1.主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型　急性单核细胞性白血病，单核系细胞大多数为阳性，阳性反应能被氟化钠抑制；急性粒细胞白血病，原粒细胞呈阴性或阳性，阳性反应能不被氟化钠抑制；急性早幼粒细胞性白血病，早幼粒细胞呈强阳性，阳性反应能不被氟化钠抑制；急性淋巴细胞白血病，原幼淋巴细胞多为阴性，少数淋巴细胞为弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。急性粒-单细胞白血病，原粒细胞呈阳性或阴性，阳性反应不能被氟化钠抑制，单核系细胞阳性反应能被氟化钠抑制。

2.辅助诊断红血病和红白血病　异常幼红细胞可呈阳性反应不能被氟化钠抑制。

七、其他血细胞化学染色

由于血细胞表面分子学的迅速发展和实验应用，血细胞化学染色方法如α-丁酸奈酚染色、氯化醋酸AS-D奈酯酶染色等已不再常用故不作介绍。