细胞凋亡检验

第七节　细胞凋亡检验

一、细胞凋亡形态学检测

1.显微镜观察　体外培养细胞一旦凋亡即离壁变圆、解聚、膜皱折、遮光性下降。HE染色见核浓缩，聚集至核膜下形成半月形、蹄形或镰形。电镜或相差显微镜能见到核碎裂的三维改变。用于染色的染料有：蛋白质染料二脒-2-苯基吲哚（PAPI）和硫酸罗丹明101；DNA染料碘化丙啶（PI），7-氨基放线菌素D（7-AMD或吖啶橙（AO）。

2.FCM分析　细胞凋亡的早期出现皱折、体积变小、密度增加和光散射降低。通过FCM分析可发现前向光散射（FSC）降低和侧向光散射（SSC）增加。但机械损伤的坏死细胞也可见FSC降低。

二、细胞凋亡细胞膜结构和功能改变检验

1.染料排除法　除了用电镜能反映细胞膜完整外，还可以用染料排除法如台粉蓝、PI等。坏死细胞膜破损，可被染料着色；而凋亡细胞膜完整，不被着色，但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死，因此，该法不能单独用来判断细胞凋亡。

2.膜磷脂酰丝氨酸（PS）检测　凋亡细胞早期膜结构的改变是活细胞膜脂质双层内侧的PS翻转至外侧。抗凝剂annexin-v与PI有很高的亲和力，annexin-v与凋亡细胞结合的最佳时间在胞浆膜对PI排除力伤失之前，而在染色质浓缩之后。因此，用荧光标记的annexin-v与PI双染色，可同时区分活细胞（annexin-v与PI双阴性）、凋亡早期细胞（annexin-v阳性，PI阴性）和凋亡晚期或坏死细胞（annexin-v与PI双阳性）。本法操作时将细胞收集后应在22℃立即标记，然后加PI，立即在FCM上检测。时间过长会影响结果的准确性。本法能区别凋亡早、晚或坏死细胞，并能确定三者的比例。但并不是所有的细胞凋亡均表现出PS的外翻，故限制了其广泛应用。

三、凋亡细胞DNA断裂检测

1.凝胶电泳法　凋亡细胞核DNA断裂成180～200bp倍数的单/寡聚核苷酸，提取的DNA在凝胶电泳中形成梯形条带，它是凋亡较特异的结果。也有DNA降解虽属典型凋亡，方法简便。可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。

2.DNA原位变性敏感性检测　在适当条件下，AO可与单链和双链DNA产生不同标记，与ssDNA反应发红荧光，插入dsDNA时发绿荧光。增殖和凋亡细胞有大量染色质浓缩，DNA对变性的敏感性高于静止期细胞。AO标记前者发强的红荧光，弱的绿荧光；相反，静止期细胞发强的绿荧光和弱的红荧光。本法优点是检测无核内核小体DNA降解，而其他方法又检测不出的凋亡细胞。

3.DNA链断裂点标记　常用末端核苷酸转移酶（TdT）脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）缺口末端标记（TUNEL）法。只要有DNA链断裂即可检出，甚至早于形态学改变，该法是目前普遍采用的一种方法，技术已成熟，且有较好的试剂盒供应。

4.DNA含量检测　DNA链断裂后形成的小分子DNA片断从细胞漏出，是细胞内DNA减少，PI标记FCM分析时，在G₀/G₁期峰前出现亚G₁期峰或A峰。本法简便、快捷、易于掌握，标本可固定后同批处理，最大优势是能确定细胞周期，应用广泛。但细胞生长并非同步，在一个周期内常有凋亡早、晚期和已坏死尚未解体的细胞混在一起，呈不规则分布，因此，不一定能准确反映周期特异性。

四、临床意义

血液系统疾病尤其是血液系统肿瘤致病原因是多方面的，而现在的研究发现造血细胞的凋亡或抑制凋亡与疾病如白血病、淋巴瘤有密切关系。因此，研究和分析细胞凋亡在血液病中有重要意义：①阐明血液系统疾病发生的分子机制；②阐明抗肿瘤药物在治疗血液系统疾病中的意义；③在诊断或辅助诊断上的价值；④提供恶性血液病基因治疗的新方法。

1.Fas/APO-I与血液肿瘤　Fas是肿瘤坏死因子受体，是细胞膜表面分子，研究证明Fas与APO-I均为细胞膜表面分子，其实为同一分子。它们与相应的配体或抗体结合后，介导表达Fas或APO-I分子的细胞凋亡发生。

（1）Fas/APO-I与急性淋巴细胞白血病：Fas/APO-I对ALL的恶性淋巴细胞生长有调节作用。而Fas/APO-I阳性的ALL可能是ALL的新亚群，可用抗Fas/APO-I抗体或配体诱导细胞凋亡的机制，来设计ALL的新方案。

（2）Fas/APO-I与成人T细胞白血病：在此病的T细胞上也有明显的Fas/APO-I抗原的表达，用病人的T细胞与Fas/APO-I抗体孵育，可以抑制自发的或细胞因子介导的DNA合成。因而提高Fas/APO-I介导的T细胞凋亡是设计ALT治疗方案的新思路。

（3）Fas/APO-Ⅰ与Burkitt淋巴瘤：Burkitt淋巴瘤患者多数EBV阳性，但EBV阳性、EBV阴性的BL细胞表面皆为CD10⁺、CD21^-、CD23^-、CD30^-、CD39^-、CD70^-、CD77⁺。Fas/APO-Ⅰ抗原阳性的BL细胞膜上的抗原型可以漂移（shift）。正常的B细胞上表达APO-I抗原。B细胞成熟、增生以及清除过程中，都有Fas抗原分子的表达和参与。因此细胞上表达Fas，因此可以用Fas/APO-Ⅰ诱导细胞的凋亡。

2.bcl-2与B细胞淋巴瘤　bcl-2基因可抑制或阻断细胞凋亡，因此认为这是B细胞淋巴瘤能不断生长繁殖的一种分子机制。有资料表明p53与bcl-2之间存在某种关系，bcl-2基因的转移和表达，在一定程度上抑制了p53诱导的细胞凋亡。在慢性B淋巴细胞白血病的模型研究中，证明了用抗Fas单克隆抗体诱导慢性B淋巴细胞白血病细胞发生凋亡，bcl-2的mRNA转录水平显著降低。因此bcl-2和Fas/APO-Ⅰ之间存在着某种关系，即正负调节细胞凋亡。

3.bcr-abl与慢性粒细胞白血病　慢粒发生的重要分子机制与ph染色体所形成的bcr-abl融合基因，该基因编码一种分子量为210000的融合蛋白，此蛋白具有较高的酪氨酸激酶活性。针对bcr-abl融合基因断裂位点的分子可特异性诱导CML病人造血前提细胞的凋亡过程，因此bcr-abl抑制CML病人造血前提细胞的凋亡的一种基因。

4.细胞凋亡与抗肿瘤药物　较多的抗肿瘤药物治疗肿瘤的一个机制是诱导肿瘤细胞的凋亡，如治疗白血病的4-羟基过氧化环磷酰胺，阿糖胞苷、氮芥类、顺铂等。体外可用细胞株进行凋亡分析。抗肿瘤治疗失效的主要是耐药，现在的研究证明多耐药性也与细胞凋亡有关，多耐药性也是影响程序性细胞凋亡的一个重要原因。