血液分子生物学检验

第八节　血液分子生物学检验

血液分子生物学检验是以血红蛋白为先导，已经在多种遗传并检测、产前诊断和携带者检查中发挥作用。自采用分子杂交技术成功地进行了ɑ-地中海贫血的基因诊断以来，基因诊断技术迅速发展，如PCR技术、DNA测序技术、限制性片断长度多态性、转基因技术及基因芯片技术等，成果累累。随着人类基因组计划的完成，推动了 后基因计划—蛋白质基因组学和细胞组学的发展，造血细胞与非造血细胞之间的关系分子又是血液病基因诊断的一项新内容，细胞与蛋白质的关系依赖于遗传基因。因此，积阴德表达、细胞之间和细胞内的信号传导、特异的血液病的基因或融合基因的检测将是血液分子检验的主要内容和方向。可见血液分子生物学检验在血液疾病的基因分析、诊断、分型、指导治疗、判断预后和微小残留病灶的检测等方面起着重要作用。

一、核酸分子杂交技术

1.Sonthern印迹杂交　是一种常用于分析DNA结构的杂交技术。由Sonthern印迹和分子杂交两部分组成。待测的基因DNA经限制性核酸内切酶消化后，酶解片断经琼脂凝胶电泳，将DNA片断按分子大小分开，在将其从凝胶中印迹到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，以放射性或非放射性标记的DNA探针与固相支持上的DNA杂交，根据探针的标记特性用相应的方法显示杂交带，对待测DNA进行分析。

2.northern印迹杂交　是一种常用于分析DNA结构的杂交技术。待测RNA经变性及琼脂糖电泳分离后，RNA分子按大小不同相互分开，随后将其转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后用DNA或RNA探针杂交，按探针的标记特性对杂交信号进行检测，对待测RNA进行分析。

3.核酸原位杂交　以放射性或非放射性标记的DNA或RNA探针在组织、细胞及染色体上与其相关的核酸序列杂交，由于非放射性标记探针具有前述优点以及在原位杂交中具有稳定性好，显色快及易于观察等优点，近年来应用普遍。其中荧光原位杂交技术将生物素标记的探针与中期或间期染色体杂交，通过间接免疫荧光法使信号放大，染色体显带后用IP染色，根据FITC/PT的激发一发射光波长，选择荧光显微镜进行观察，染色体显红色，染色体上特异杂交带显黄绿色。中期染色体的原位杂交可用于基因定位、基因缺失、基因易位及融合基因的检测。在分裂象细胞数目量少或重量差时，间期细胞的原位杂交可在短时间内对大量细胞进行分析，对于检测染色体异常、肿瘤致病基因和肿瘤微小残留病灶有广阔的发展前景。

二、聚合酶链反应

1.原理　PCR是一种模拟天然DNA合成过程的选择性体外扩增方法。在加热条件下，DNA变性，螺旋解开，在退火条件下，引物与模板DNA结合，在TaqDNA聚合物、镁离子及合适的pH的缓冲液存在的条件下。引物延伸过程第二轮PCR反应。把基因拷贝由2个增至4个。在反应的初期原来的DNA起模板的作用。随着循环数的递增。由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板。重复上述过程20～30个循环，就可以把基因拷贝数以指数形式增加上百万倍，从而达到体外扩增核酸序列的目的。

2.PCR产物分析

（1）琼脂糖凝胶电泳：在PH8.0时，DNA分子带负电荷，在电场钟向正极移动，其移动的速率与分子的大小成反比。待分离的PCR产物中要加入溴化乙啶，在紫外灯下观察电泳条带时，溴化乙啶与DNA结合后，发出棕红色的荧光。

（2）sonthern印迹杂交：将琼脂糖凝胶电泳分离的PCR产物在原位变性，并将变性产物转移到硝酸纤维素或尼龙膜上，然后用生物素等标记探针检测该产物。

（3）斑点杂交法：当扩增产物是多条带纹时，用斑点杂交法分析PCR产物首先将扩增的片段固定在硝酸纤维素或尼龙膜上，然后用生物素等标记探针杂交，将不同的探针固定在同一尼龙膜上，用标记的PCR产物作探针杂交，根据杂交点的位置即可判断产物序列变异的种类。点杂交有助于遗传病的基因诊断，还可用于基因多态性分析。

（4）PCR-ELISA法：待测的PCR产物需携带有生物素等固定集团和PCR地高辛等检测集团。这可通过将PCR反应中的两个引物5^，端分别标记生物素和地高辛来实现。PCR反应产物中带生物素标记的引物延伸链与带地高辛的引物延链形成双链，生物素等固定集团可与微孔板上包被的亲和素结合，向微孔板中加入酶标记的地高辛抗体和生色底物，即对PCR产物进行ELISA分析。

（5）原位杂交法：PCR产物并可用原位杂交法检测，所用探针可用生物素、地高辛或荧光标记。

三、基因芯片技术

基因芯片技术又称DNA微陈列，基因芯片技术已成为21世纪生命科学中应用广泛的一项快速高效的分子生物学技术。所谓DNAchip就是固定大量以特定排列方式的基因探针或基因片段的硅片，玻片和塑料片，样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，与微陈列杂交后再通过荧光扫描仪及计算机分析，即可获得样品大量基因序列及表达信息。DNAchip应用广泛，现在主要用于病原检测、细胞的基因表达检测、疾病相关基因突变及单核苷酸多态分析等。

四、临床评价

分子生物学的发展推动了血液分子生物学的发展，利用分子生物学技术对红细胞、白细胞和血小板等细胞进行分子水平的基础研究，不断地从分子水平阐明造血功能及分子调节机制，细胞因子及其受体分子结构，促凝和抗凝因子及纤维蛋白系统的机构和功能关系，抗原受体基因的重排等。血液分子生物学的基础研究为血液病基因诊断提供了依据，血液分子生物学检验主要目标也是对血液病基因诊断。体细胞基因突变可引起各种遗传学血液病，如α-珠蛋白基因的缺陷造成的α-地中海贫血；凝血因子VIII基因的点突变，缺失和插入，导致甲型血友病；基因的扩增、基因点突变、基因重排及基因融合的形成常引起恶性血液病如白细胞和淋巴瘤的发生。可见血液分子生物学检验在血液疾病的基因分析、诊断、分型、指导治疗、判断预后和微小残留病灶检测等方面有重要作用。

1.恶性血液病融合基因的检测

（1）慢性粒细胞白细胞bcr-abl融合基因：应用传统的southern印迹杂交法，以BCR为探针，发现所有ph阳性的慢粒均有该基因的重组，而多数ph阴性的慢粒也有bcr-abl基因重组。由于PCR方法灵敏、快速，目前多采用逆转录酶-PCR法来检测慢粒的融合基因，即以待测mRNA-ABL转录本为模板，用逆转录酶合成bcr-abl接头部顺序的Cdna，设计扩增引物，经PCR扩增后检测扩增产物。目前采用FISH法对染色体原位检测bcr-abl也是有效的方法。

（2）急性早幼粒细胞性白血病PML-RARA融合基因：通过southern印迹杂交，RT-PCR及FISH法进行检测。也有少数患者无t（15；17），而有PML-RARA融合。少数患者，细胞遗传学检查为t（11；17）或t（5；17）经分子水平检测分别为PLZF-RARa和NPM-RARa融合基因，或有更复杂的染色体易位。

2.免疫球蛋白重链（IgH）基因和T细胞受体基因重排的内测　IgH和TCR的编码基因具有多态性。IgH基因重排是产生抗体多样性和独特性的重要原因。由于白血病细胞起源于造血干细胞，所以白血病细胞是单克隆性的。用PCR方法对重排基因进行扩增，正常白细胞的扩增产物大小不等，呈模糊的阶梯状。而白血病细胞扩增产物经电泳后条带是单一的。约80%的B淋巴细胞性白血病可检测到IgH基因重排。通过PCR方法检测IgH和TCR基因重排，有助于急性淋巴细胞白血病的分型及微小残留病灶病的检测。

3.遗传血液病的诊断　血红蛋白病常见的遗传性溶血性疾病，血友病是常见的遗传性出血性疾病。基因缺陷包括基因缺失、点突变、插入、倒立等。对于基因重排，可通过PR-PCR进行检测；对于点突变可用PCR结合酶切位点分析，即当点突变使某一酶切位点消失或在某一区域出现新的酶切位点时，可用该酶切点二侧的引物进行扩增，然后将扩增产物用适当的内切酶切割，根据电泳图谱来判断有无内切酶的改变。对于与限制性内切酶点无连锁的点突变则可以采用PCR结合特异寡核苷酸探针斑点杂交法进行诊断。

4.HLA基因多态性检测　采用PCR扩增产物的反向杂交，十分简便。将每个位点的所有寡核苷酸探针固定在固相支持物上，引物先经生物素化后，进行待测DNA的基因扩增，从而得到生物素化的DNA扩大产物。用此产物与膜上的探针杂交，然后进行染色或化学发光。这样每个标本只需杂交一次即可完成。此方法用于骨髓移植的HLA基因配型及HLA基因与疾病的相关性分析。

5.肿瘤细胞多耐药性基因的检测　耐药性（MDR）是指肿瘤细胞接触了一种药物后，不但对该药产生了耐药性，而且对其他结构和作用机制不同的药物也产生耐药性。研究发现，MDR的出现与多耐药基因过度表达有关，目前已建立northern印迹法、斑点和狭缝印迹法、PR-PCR法及原位杂交法，从mRNA水平对患者进行测定，了解肿瘤细胞的耐药性。

6.基因治疗　基因治疗的目的是应用DNA重排技术和基因转移技术，把野生型的基因导入患者体细胞中，合成为正常的基因产物，来弥补缺陷基因的功能，从而使疾病得到纠正。目前认为基因治疗的靶细胞是造血干细胞或间质干细胞等。常用的载体是逆转病毒和腺病毒。采用含人因子Ⅸ基因逆转病毒载体转染血友病B患者的原代皮肤成纤维细胞，使其表达一定浓度的因子Ⅸ，这将为血友病B治疗提供新的方法。