第二章 红细胞检查
一、红细胞一般检查
（一）红细胞计数
原理 计数板法：用等渗稀释液将血液进行稀释，混合均匀后充入计数池内在显微镜下计数，求得每立方毫米血液中的红细胞数，进而换算为每升血液内红细胞数。细胞可采用数上不数下，数左不数右的方法处理，以保证计数的准确性。
参考值 男，4.0～5.5×1012/L；女，3.5～5.0×1012/L 新生儿，6.0～7.0×1012 /L
临床评价
1.红细胞增多可见于各种原因引起的血浆中水分丢失、血液浓缩、缺氧如烧伤、肺心病及各种红细胞增多症等。
2.红细胞数量减少见于血浆容量增加引起血液稀释、造血功能障碍、各种贫血、各种原因所致的红细胞丢失及破坏过多等。
（二）氰化高铁血红蛋白比色法（HiCN）
原理 血红蛋白与试剂中的高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白，再与氰结合转化生成稳定的棕红色的氰化高铁血红蛋白。在分光光度计波长540nm处测定其吸光度，经计算可得到血红蛋白浓度。此法被国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐为
标准参考方法，其准确性和稳定性被认为是最好的。
参考值 男：120～160g/L；女：110～150g/I；新生儿：170～200g/L
临床评价
1.血红蛋白生理性增加：新生儿，常年位居于高原的人。
2.血红蛋白病理性增加：真性红细胞增多症，代偿性红细胞增多症如先天性心脏病，慢性肺心病，大量脱水等。
3.血红蛋白病理性减少：各种贫血及溶血性疾病，白血病，大量失血，大手术后，产后，某些放疗及化疗后。
（三）红细胞比积测定
原理 将定量的抗凝血液用一定的速度和时间离心沉淀后，观察压实红细胞和上层血浆体积的比值（L/L）
参考值 男：0.42～0.49L/L（42%～49%）
女：0.37～0.43L/L（37%～43%）
临床评价
1.增高：大面积烧伤、各种原因引起的红细胞与血红蛋白增多、脱水等。
2.减少：各种贫血时随红细胞数的减少而有程度不同的降低。
（四）三种红细胞参数平均值的计算
原理 根据红细胞、血红蛋白浓度和红细胞比积，计算红细胞平均容量、红细胞平均血红蛋白量、红细胞平均血红蛋白浓度，用作贫血的形态学分类。
计算方法
1.平均红细胞体积（MCV）是指每个红细胞体积的均值。
计算公式：
MCV＝每升血液中红细胞压积（L/ L）×1015/每升血液中红细胞数量（fl）
2.平均红细胞血红蛋白（MCH）指每个红细胞所含的血红蛋白平均量。
计算公式：
MCH＝每升血液中血红蛋白浓度（g）×1012/每升血液中红细胞数量（pg）。
3.平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）指平均每升红细胞中所含的血红蛋白克数（g/L）。
计算公式：
MCHC＝每升血液中血红蛋白克数（g/L）/每升血液中红细胞压积L/L）值
参考值
平均红细胞体积（MCV）80～98fl。
平均红细胞血红蛋白（MCH）28～32pg。
平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）320～360g/L。
（五）红细胞沉降率测定
原理 抗凝血液置于特制刻度测定管内，垂直立于室温中，一定时间时观察上层血浆高度的毫米数。
参考值 男：＜15mm/60min；
女：＜20mm/60min
临床评价
1.生理性增快：年幼小儿、经期、妊娠3个月至产后1个月。
2.病理性增快：急性炎症、结缔组织病、活动性结核、风湿热活动期、贫血、恶性肿瘤、重金属中毒等。
（六）网织红细胞计数
原理 煌焦油蓝染色法：煌焦油蓝对血液进行活体染色后可将网织红细胞内残存的嗜碱性RNA物质染色，使红细胞内的网状结构呈现浅蓝或深蓝色，制成血片后可在显微镜下观察和计数。
参考值 成人：0.5%～1.5%；
儿童：2.0%～6.0%
临床评价
1.网织细胞增加 常表示骨髓造血功能旺盛。多见于溶血性贫血、恶性贫血和缺铁性贫血，经维生素B12或铁剂治疗后呈显著增加，表示疗效良好。
2.网织细胞减少 常见于骨髓增生低下的疾病，如再生障碍性贫血等。
（七）自动血细胞计数仪法
原理 血细胞计数仪以电阻法最为常见，此外还有激光法等。电阻式血细胞计数仪采用在一个微小孔内外安放正负电极一对，两电极间保持恒定的电压，当血细胞悬浮于导电稀释液中作为不良导体通过小孔时，微孔间的电阻发生改变，两电极间恒定电压随之发生的变化，在电路中产生一个脉冲，这个脉冲的大小与通过小孔的细胞体积大小成正比。据此原理，每一个通过小孔的细胞既被计数又同时测量了体积。按一定比例稀释的血液，以一定的速度和一定的量不断地通过小孔，此时既可得到单位体积内血细胞数量，也可测得每个细胞的体积，因此可以方便地计算出单位体积内红细胞总数，又可测得平均红细胞体积。 参数 现在常见的血细胞计数仪多为多参数型血细胞计数仪，一般可同时测定红细胞、白细胞、血红蛋白、血小板及它们相关的多种参数MCH、MCHC、MCH、RDW（红细胞体积分布宽度red cell volume distribution width）、MPV等。
临床评价
红细胞测定参数与贫血性疾病的关系，可通过表中参数的分布对贫血进行初步分类和诊断。
项目 MCH（pg） MCV（fl） MCHC（g/L）
正常 28～32 80～98 320～360
大细胞性贫血 ＞正常， 33～50 ＞正常， 100～160 正常
正常细胞性贫血 正常 正常 正常
单纯细胞性贫血 ＜正常， 21～24 ＜正常， 70～80 正常
小低色素性贫血 ＜正常， 12～28 ＜正常， 50～80 ＜正常
二、有关铁指标的测定
（一）血清铁测定（measurement of serum iron）
原理 血清铁 Fe 形式与转铁蛋白（transferrin，Tf）结合存在，降低介质的 pH及加入还原剂（如抗坏血酸、盐酸羟胺等）使高铁（Fe3＋）还原为Fe2＋，则转铁蛋白对铁离子的亲和力降低而解离，解离出的二价铁离子（Fe2＋ ）与显色剂（菲咯嗪和2，2′-联吡啶等）反应，生成有色络合物，同时作标准对照，计算出血清铁的含量。
参考值 成年男性11.6～31.3μmol/L，女性9.0～30.4μmol/L
临床评价
血清铁降低常见于生理性铁需要量增加、缺铁性贫血、急性感染、恶性肿瘤等。各种原因所引起的缺铁性贫血患者，血清铁含量均明显降低，故可用于鉴别缺铁与非缺铁性贫血的诊断。
血清铁增高常于急性肝炎、恶性贫血、再生障碍性贫血、溶血性贫血及巨幼细胞贫血等。
（二）血清总铁结合力（total iron binding capacity，TIBC）测定
原理 总铁结合力是指血清中转铁蛋白能与铁结合的总量。在血清中加入过量的铁，使之与血清中未带铁的转铁蛋白结合并达到饱和。多余的铁用轻质碳酸镁吸附除去，然后按血清铁操作，测定铁的含量.并计算出总铁结合力， 总铁结合力减去血清铁，则为未饱和铁结合力（UIBC）。
参考值 TIBC：男性50～77μmol/L，女性54～77umol/L
UIBC：25.1～51.9μmol/L
临床评价
增高：见于缺铁性贫血患者、红细胞增多症。
减低：见于肝疾病、慢性感染、肾病综合征和恶性肿瘤。
（三）血清铁蛋白测定（measurement of serum ferritin）
原理 血清铁蛋白测定一般采用放射免疫法。人血清铁蛋白和 125Ⅰ标记的铁蛋白与兔抗人铁蛋白抗体竞争结合，平衡后形成抗原抗体复合物，除去未结合的过多的放免标记物，洗脱结合放免标记的铁蛋白，用γ计数器与标准曲线比较，计箅出待测标本的血清铁蛋白水平。
参考值
成年男性15～200μg/L，女性12～150μg/L，小儿低于成人；青春期至中年，男性高于女性。
临床评价
血清铁蛋白是人体内铁的一种贮存形式。血清铁蛋白水平降低各种原因导致的缺铁性贫血、失血、慢性贫血。
血清铁蛋白水平增高，见于免疫系统疾病、感染、肿瘤及铁代谢障碍性疾病等。
（四）铁吸收率测定
原理 当体内缺铁时，铁蛋白的利用加快，肠道对铁吸收也增加。口服放射性 59Fe，测定体内59Fe放射性量比率的变化，可推算出铁吸收率。
参考值 正常为26.0%～35.0%
临床评价
增加：见于缺铁性贫血，可高达50%～80%。
降低：见于肠道吸收不良综合征。正常：见于正常人、再障、巨幼红细胞贫血、急性失血等。
（五）血清转铁蛋白测定（measurement of serum transferrin）
原理 免疫散射比浊法；利用抗人转铁蛋白血清与待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体复合物，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，可计算出转铁蛋白含量。目前还有放射免疫法和电泳免疫扩散法。
参考值 免疫散射比浊法：28.6%～51.9%
临床评价
增加：见于缺铁性贫血和妊娠。
降低：常见于肝硬化、肾病综合征、恶性肿瘤、炎症。
（六）血清转铁蛋白受体测定（measurement of serum transferrin receptor）
原理 血清转铁蛋白受体测定一般采用酶联免疫双抗体夹心法。把对转铁蛋白受体特异的多克隆抗体包被在96孔板上，用标准品和未知样本与转铁蛋白受体的多克隆抗体进行反应，然后加入酶标记的对转铁蛋白受体具有特异性的多克隆抗体，使之与抗原抗体复合物进行反应，通过洗板去掉未与酶标记的多克隆抗体结合部分，再加入底物使之酶联复合物发生颜色反应。颜色的深浅与转铁蛋白受体的量成正比。
参考值 以不同浓度标准品的吸光度值在普通坐标纸上绘制标准曲线，通过标准曲线上查出未知标本的转铁蛋白受体水平。
临床评价
升高：常见于缺铁性贫血和溶血性贫血。
降低：见于再生障碍性贫血、慢性病贫血及肾功能衰竭等。
二、叶酸和维生素B12的测定
（一）血清和红细胞叶酸测定
原理 叶酸测定（measurement of folacin） 主要为放射免疫法，核素与叶酸结合，产生γ-放射碘叶酸化合物，放射活性与血清或红细胞的叶酸含量成比例，检测其放射活性，与已知标准对照，计算出叶酸量。
参考值 血清叶酸 成年男性8.61～23.8nmol/L 女性7.93～20.4nmol/L 红细胞叶酸 成人340～1020nmol/L红细胞。
临床评价
红细胞与血清叶酸浓度相差几十倍，体内组织叶酸缺乏但当未发生幼红细胞贫血时，红细胞叶酸测定对判断叶酸缺乏尤其有价值。叶酸减少有助诊断由于叶酸缺乏引起的巨幼细胞贫血，此外可见于红细胞过度增生，叶酸增加，如溶贫、骨髓增生性疾病等。
（二）血清维生素B12测定（measurement of vitamin B12）
原理 放射免疫法，用抗氧化剂和氰化钾在碱性环境下（pH＞12），将人血清中维生素B12从载体蛋白中释放出来。加入 57Co标记的维生素B12，与固定在微晶纤颗粒上纯化的维生素B12结合物（纯化的猪内源内因子）竞争结合，检测其放射性，其量与受检血清的维生素B12含量成反比，与标准管作对照，换算出维生素含量。
参考值 成人148～660pmol/L
临床评价
血维生素B12降低对巨幼细胞贫血诊断有重要价值；而白血病患者血维生素B12明显升高；真性红细胞增多症、某些恶性肿瘤和肝细胞损伤时也可增
（三）血清维生素B12吸收试验
原理 给受检者口服放射性核素57Co的维生素B120.5μg，2小时后肌注未标记的维生素B121mg，收集24小时尿测定 Co排出量。
参考值 正常人＞7%
临床评价
巨幼细胞贫血＜7%，恶性贫血＜5%
（四）血清内因子阻断抗体测定
原理 一般用放射免疫法。维土素B12的吸收要靠胃壁细胞分泌的内因子。内因子阻断抗体能阻断维生素B12与内因子的结合而影响维生素B12的吸收。用57Co标记的维生素B12与血清中的内因子结合，形成57Co标记的维生素B12-内因子结合物。当存在内因子抗体时，结合物的量减少，由γ计数可测得减少的数量，而得知内因子抗体的存在。
参考值 正常人为阴性，比值≤1.00±0.10阳性：比值阳性对照血清比值±0.10
临床评价
内因子阻断抗体阳性：多见于由维生素B12缺乏引起的巨幼细胞贫血、恶性贫血等。
四、免疫性溶血性贫血的检验
（一）抗人球蛋白试验（Coombs试验）
原理 抗人球蛋白试验（Coombs试验）检测自身免疫性溶血性贫血的自身抗体（IgG）。分为检测红细胞表面有无不完全抗体的直接抗人球蛋白试验（direct antiglobulin test，DAGT）和检测血清中有无不完全抗体的间接抗人球蛋白试验（inderect antiglobulin test，IAGT）。直接试验应用抗人球蛋白试剂（IgG、IgM、IgA或补体3（C3）与红细胞表面的IgG分子结合，如红细胞表面存在自身抗体，出现凝集反应。间接试验应用Rh（D）阳性O型正常人红细胞与受检血清混合孵育，如血清中存在不完全抗体，红细胞致敏，再加入抗人球蛋白血清，可出现凝集。
参考值 正常人直接和间接抗人球蛋白试验均为阴性。
临床评价
身免疫性溶血性贫血、冷凝集综合征、新生儿同种免疫溶血病、药物诱发的免疫性溶血性贫血、阵发性冷性血红蛋白尿等直接抗人球蛋白试验阳性，当抗体与红细胞结合后，有过剩抗体时直接和间接试验均为阳性。
（二）冷凝集素试验
原理 冷凝集素综合征的患者血清中存在冷凝集素，为IgM类完全抗体，在低温时可使自身红细胞、O型红细胞或与受检者血型相同的红细胞发生凝集。凝集反应的高峰在0～4℃，当温度回升到37℃时凝集消失
参考值 正常人血清抗红细胞抗原的IgM冷凝集素效价＜1:3（4℃）
临床评价
冷凝集素综合征患者为阳性，效价可达1：1000以上。淋巴瘤、支原体肺炎、疟疾、流行性感冒等可引起冷凝集效价继发性增高。
（三）冷热溶血试验
原理 阵发性冷性血红蛋白尿症患者血清中有一种特殊的冷反应抗体（Donath-Land-steiner抗体），在20℃以下（常为0～4℃）时与红细胞结合，同时吸附补体，但不溶血。当温度升至37℃时，补体激活，红细胞膜破坏而发生急性血管内溶血。
参考值 正常人试验为阴性
临床评价
阵发性冷性血红蛋白尿症病人为阳性，D-L抗体效价可高于1 : 40。病毒感染可出现阳性反应。
五、红细胞酶缺陷的检验
（一）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的荧光斑点试验
原理 在G-6-PD和NADP+存在下，G-6-PD能使NADP+还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G-6-PD活性。
参考值 正常人有很强的荧光；G-6-PD缺陷者荧光很弱或无荧光；杂合子或某些G-6-PD变异者则可能有轻到中度荧光。正常人酶活性为（12.1±2.09U/gHb）
临床评价
G-6-PD缺陷见于蚕豆病和伯氨喹啉型药物性溶血贫血等。
（二）丙酮酸激酶的荧光斑点试验
原理 丙酮酸激酶（PK）在ADP存在下能催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化成丙酮酸，在辅酶Ⅰ还原型（NADPH）存在的情况下，丙酮酸被乳酸脱氢酶（LDH）转化为乳酸，若标记荧光于NADPH上，此时有荧光的NADPH变为无荧光的NAD。
参考值 正常人丙酮酸激酶活性斑点在25分钟内消失。酶活性（15.0±1.99）U/gHb。
临床评价
荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光25～60分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光60分钟不消失。
（三）谷胱甘肽还原酶缺陷检测
原理 谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）催化反应中NADPH转化为NADP+，荧光消失，通过365nm 处观察荧光斑点消失的时间（GR荧光斑点试验）反映谷胱甘胱还原酶的活性，或直接测定吸光度的变化（GR活性定量试验）计算GR的活性。
参考值
GR荧光斑点试验：正常人荧光斑点15min内消失。
GR活性定量：（7.17±1.09）U/gLHb
临床评价
谷胱甘肽还原酶缺乏时，GR荧光斑点试验15分钟以后还有荧光存在，GR活性定量试验活性低于7.17U/gHb。
（四）高铁血红蛋白还原试验（methemoglobin reduction test，MHb-RT）
原理 亚硝酸盐作用于红细胞可使血红蛋白变成高铁血红蛋白（MHb，褐色），：MHb在 NADPH 作用下通过亚甲蓝的递氢作用还原为亚铁血红蛋白（红色）。G-6-PD 缺乏的红细胞由于NADPH生成减少或缺乏，MHb不被还原或还原速度显著减慢，仍保持MHb的褐色。通过颜色变化，应用比色可观察还原的多少。
参考值 正常人高铁血红蛋白还原率≥75%（脐血≥77%）
临床评价
G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。中间缺乏（杂合子）为31%～74%，严重缺乏（半合子或纯合子） ＜30%。
（五）变性珠蛋白小体生成试验
原理 G-6-PD 缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于 37℃孵育 2～4 小时，用煌焦油蓝染色观察红细胞总珠蛋白小体的生成情况，计算含5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率。
参考值 正常人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞一般＜30%。
临床评价
G-6-PD缺乏症常高于45%，故可作为G-6-PD缺乏的筛检试验。但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为75%～84%，HbH病和化学物质中毒时也增高。
六、红细胞膜缺陷的检验
（一）红细胞渗透脆性试验（osmotic fragility test）
原理 渗透脆性试验检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。红细胞在低渗盐溶液中，当水渗透其内部达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂。根据不同浓度低渗盐溶液中红细胞溶血的情况，反映红细胞表面积与容积的比值，反映其对低渗盐溶液的抵抗力。比值愈小，红细胞抵抗力愈小，渗透脆性增加。反之抵抗力增大。
参考值
开始溶血：75.2～82.1mmol/L（4.4～4.8g/L）NaCL溶液
完全溶血：47.9～54.7mmol/L（2.8～3.2g/L）NaCL溶液
临床评价
脆性增加：见于遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症、部分自身免疫性溶血性贫血。
脆性减低：主要见于珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白C、D、E病、低色素性贫血、肝疾病等。
（二）自身溶血试验及其纠正试验
原理 红细胞在37℃孵育48小时，其间由于膜异常引起钠内流现象明显增加，ATP消耗过多；或糖酵解途径酶缺乏所引起ATP生成不足等原因可导致溶血，称为自身溶血试验。
参考值 正常人红细胞孵育 48 小时，不加纠正物的溶血率＜3.5%，加葡萄糖的溶血率＜1.0%，加ATP纠正物的溶血率＜0.8%。
临床评价
（1）遗传性球形红细胞增多症自身溶血率增加，加入葡萄糖或 ATP 后明显纠正。
（2）G-6-PD缺乏症等戊糖旁路代谢缺陷的病人自身溶血率增加，能被葡萄糖纠正。
（3）丙酮酸激酶缺乏症时不能利用葡萄糖产生ATP，其自身溶血率明显增加，加葡萄糖不能纠正，加ATP可纠正。
（4）获得性溶血性贫血或自身免疫性溶血时试验结果常各不相同，对诊断意义不大。
（5）本试验不够敏感和特异，仅对遗传性球形红细胞增多症有较大诊断价值，其他仅作为筛选试验。
（三）酸化甘油溶血试验（acidified glycerin hemolysis test，AGLT）
原理 酸化甘油溶血试验 当甘油存在于低渗溶液氯化钠磷酸缓冲液时，可阻止其中的水快速进入红细胞内，使溶血过程缓慢。但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜脂质减少。当红细胞膜蛋白及膜脂质有缺陷时，它们在 Ph6.85 的甘油缓冲液中比正常红细胞溶液速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至50%的时间（AGLT50）明显缩短。
参考值 正常人AGLT50＞290s
临床评价
遗传性球形红细胞增多症AGLT50明显缩短（25～150s）。自身免疫性溶血性贫血、肾功能衰竭、妊娠等AGLT50也可缩短。
（四）高渗冷溶血试验（hyperosmotic cold hemolysis test）
原理 在高渗状态下，温度然变化影响红细胞膜脂质的流动性，并可能累及膜磷脂与膜骨架蛋白结合位点（如肌动蛋白-收缩蛋白体系），红细胞容易破裂而发生溶血。当膜蛋白缺陷致膜表面积与体积比值降低，溶血率明显增高。当膜蛋白缺陷致膜表面积与体积比值增高，溶血率降低。高渗冷溶血试验即测定红细胞在不同浓度的高渗缓冲液中，从37℃水浴立即置于0℃水浴一定时间的最大溶血率。
参考值 9mmol/L或12mmol/L糖最大溶血率66.5%～74.1% ，7mmol/L糖最大溶血率0.1%～16.9%
临床评价
（1）遗传性球形红细胞增多症明显增加。
（2）珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白明显降低。
（3）自身免疫性溶血性贫血基本正常。
（五）红细胞膜蛋白电泳分析
原理 将制备的红细胞膜样品进行SDS-PAGE 电泳，根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋白组分百分率。
参考值 各种膜蛋白组分百分率变化较大，多以正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较。或以带3蛋白为基准，各膜蛋白含量以与带3蛋白的比例表示。
临床评价
许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常。各种膜缺陷疾病如遗传性球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常。某些血红蛋白病骨架蛋白可明显异常。
七、血红蛋白异常的检验
（一）红细胞包涵体试验（Heinz-body forming test）
原理 红细胞包涵体试验是将煌焦油蓝液与新选血液一起孵育，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。
参考值 正常人＜0.01（1%）。
临床评价
（1）不稳定血红蛋白病：孵育1～3小时多数红细胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体。G-6-PD缺乏或红细胞还原酶缺乏及化学中毒物质等，红细胞中也可出现包涵体。
（2）HbH病：孵育1小时就可出现包涵体，也叫HbH包涵体。
（二）血红蛋白电泳检测
原理 血红蛋白电泳（hemoglobin electrophoresis）是根据不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的PH缓冲液中，缓冲液的PH大于Hb的等电点时其带负电荷，电泳时在电场中向阳性泳动；反之，Hb带正电荷向阴极泳动。经一定电压和时间的电泳，不同血红蛋白所带电荷不同、相对分子质量不同，其泳动方向和速度不同，可分离出各自的区带，同时对电泳出的各区带进行电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。
参考值 pH8.6 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳：正常血红蛋白电泳区带；HbA＞95%、HbF＜2%、HbA2为1%～3.1。pH8.6 TEB缓冲液适合于检出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易与HbA分开，HbH与Hb Barts不能分开和显示，应在选择其他缓冲液进行电泳分离。 PH6.5 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳：主要用于HbH与Hb Barts的检出。HbH等电点为5.6，在pH6.5 TEB缓冲液中电泳时泳向阳极，Hb Barts则在点样点不动，而其余的血红蛋白都向阴极移动。
临床评价
通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带。如HbE、HbH、Hb Barts、HbS、HbD和HbC等异常血红蛋白。 HbA2增多，见于β珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要实验室诊断指标。HbE病时也在HbA2区带位置处增加，但含量很大（在10%以上）。HbA2轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些白血病。
（三）抗碱血红蛋白测定
原理 胎儿血红蛋白F（HbF）具有比HbA更强抗碱能力，将待检的溶血液与一定量的氢氧化钠混匀，作用1分钟后加入半饱和硫酸铵终止碱变性反应。HbF抗碱变性作用强，没有变性存在于上清液中，HbA变性沉淀，取上清液于540nm处测定戏光度，检测出HbF的浓度。此试验也称为碱变性试验，其检测的是抗碱血红蛋白，除HbF外，Hb Barts和部分HbH也具有抗碱能力，需通过电泳鉴别。
参考值 成人＜2%，新生儿＜40%
临床评价
HbF绝对增多：珠蛋白生成障碍性贫血时 HbF 增多，重型者达 30%～90%，中间型常为5%～30%，轻型小于5%。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者，HbF可高达100%。HbF相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤等恶性疾病及再生障碍性贫血、PNH、卟啉病等。HbF生理性增多见于孕妇和新生儿。
（四）HbF酸洗脱法检测
原理 HbF具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力比HbA强。将血涂片于酸性缓冲液中孵育，含HbF的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含HbA的红细胞均被酸洗脱，不能被伊红着色。
参考值 正常血片中含 HbF 的着色红细胞：成人＜0.01（1%）；新生儿 0.55～0.85（55%～85%），以后渐渐下降，2岁后幼儿＜0.02（2%）；孕妇可有轻度增加。
临床评价
珠蛋白合成障碍性贫血着色细胞增加，重型患者大多数红细胞染成红色，轻型患者可见少数染成红色的细胞。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征全部红细胞均染为红色。
（五）异丙醇沉淀试验
原理 不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更易裂解，在异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部氢键的非极性溶剂中，不稳定血红蛋白更快地沉淀。通过观察血红蛋白液在异丙醇中的沉淀现象对不稳定血红蛋白进行筛检。
参考值 正常人血红蛋白液为阴性（30分钟内不沉淀）
临床评价
不稳定血红蛋白存在时，常于5分钟时出现沉淀，20分钟开始出现绒毛状沉淀，血液中含有较多HbF、HbH、HbE时也可出现阳性结果。
（六）热变性试验（heat instability test）
原理 根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性，观察血红蛋白液在50℃时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。
参考值 正常人热沉淀的血红蛋白＜1%
临床评价
血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋白存在
（七）尿素裂解试验
原理 尿素将血红蛋白分子的珠蛋白解离成多肽链，进行醋酸纤维膜电泳分析其肽链区带。
参考值 正常人HbA裂解为两条肽链，在pH8.5醋酸纤维膜电泳时，向阳极泳动的为β链，向阴极泳动的为α链。
临床评价
异常血红蛋白存在时，出现β、α链区带以外的异常区带。
（八）高压电泳检测
原理 通过高压电泳对异常肽链裂解的肽段进行分离，再应用纸沉析法使各肽段展开，得肽段斑点图（指纹图），对其进行分析可更准确的诊断血红蛋白病和研究异常血红蛋白结构。
参考值 正常人有正常指纹图。
临床评价
异常血红蛋白存在时，出现异常肽段的斑点，将异常肽段水解后可进行氨基酸序列分析，确定异常血红蛋白结构。
（九）血红蛋白基因PCR技术检测
原理 应用聚合酶链反应（PCR）技术检测血红蛋白基因序列，一般PCR产物用DNA印迹法、酶切法或直接测序等方法进行检测。可检测出血红蛋白基因的存在，是纯合子还是杂合子，基因缺陷的部等。
临床评价 血红蛋白异常基因的检测，可在分子水平上进行血红蛋白病的诊断和研究。
（十）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
原理 尿素或氯汞苯甲酸能破坏血红蛋白的空间结构，血红蛋白的珠蛋白可被裂解成肽链亚单位，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出各肽链区带。
参考值 正常血红蛋白HbA裂解后出现β、HbA、HbA2和α四条链。
临床评价
本试验若有异常血红蛋白肽链的区带出现，表示有异常血红蛋白存在。对珠蛋白生成障碍性贫血的诊断和鉴别有参考价值。
八、阵发性睡眠性血红蛋白尿症有关测定
（一）酸化血清溶血试验（acidifiedserum hemolysis test）
原理 阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxymal nocturnal hemoglobinuria PNH）患者体内存在对补体敏感的红细胞，酸化血清溶血试验也称Ham test，即红细胞在酸化（pH 6.4～6.5）的正常血清中孵育一定时间，补体被激活，可使PNH红细胞破坏而产生溶血。而正常红细胞不被溶解，无溶血现象。
参考值 正常人试验为阴性
临床评价
本试验阳性主要见于PNH，某些自身免疫性溶血性贫血发作严重时也可呈阳性。
（二）蛇毒因子溶血试验（venom hemolysis test）
原理 蛇毒因子溶血试验多采用从眼镜蛇毒中提取的一种低毒性蛋白质蛇毒因子，能直接激活血清中的补体3（C3），进而形成补体终末复合物（C5～C9），使对补体敏感的PNH红细胞发生溶血。
参考值 正常人溶血率＜5%
临床评价
溶血率增加，PNH的可能性大，可反映PNHⅢ型红细胞的溶血情况。正常红细胞、PNHⅠ型和Ⅱ型红细胞均不发生溶血。
（三）蔗糖溶血试验（sucrose hemolysis test）
原理 PNH患者的异常红细胞在低离子强度的蔗糖溶液中，经孵育可加强补体与红细胞膜的结合，因而增加了红细胞对补体的敏感性，致使红细胞溶破，产生溶血。
参考值 定性实验:正常为阴性；定量实验：正常溶血率＜5%
临床评价
PNH患者蔗糖溶血试验为阳性或溶血率增加，可作为PNH的过筛实验。自身免疫性溶血性贫血有的可为阳性，白血病、骨髓硬化时可出现假阳性。
九、溶血的检验
（一）红细胞寿命测定（erythrocyte life span determination）
原理 红细胞寿命测定是将放射性核素51Cr 标记的红细胞注入血循环后，逐日观察其消失率，记录成活曲线，计算出红细胞寿命。
参考值 半衰期为25～32天
临床评价
（1）溶血性贫血 红细胞寿命缩短，约为14天。
（2）再生障碍性贫血 红细胞寿命缩短，约为15～29天。
（二）血浆游离血红蛋白检测
原理 利用血红蛋白具有类过氧化物酶活性的特点，采用过氧化物酶法检测血浆游离血红蛋白（plasma free hemoglobin）。血红蛋白可催化H2O2释放新生态氧，使联苯胺氧化成为蓝紫色。根据显色深浅，可测出血浆游离血红蛋白的量。
参考值 0～40mg/L
临床评价
（1）正常情况，血浆中血红蛋白大部分与结合珠蛋白结合，仅有微量游离血红蛋白。测定血浆游离血红蛋白可判断红细胞的破坏程度。
（2）游离血红蛋白明显增高是判断血管内溶血的指征。蚕豆病、PNH、阵发性寒冷性血红蛋白尿、冷凝集素综合征、溶血性输血反应等明显增高。
（3）自身免疫性溶血性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血可轻到中度增高。
（4）血管外溶血不增高。
（三）血清结合珠蛋白检测（measurement of haptoglobin）
原理 血清结合珠蛋白检测是在待测血清中加入一定量的血红蛋白液，使之与待测血清中的结合珠蛋白（Hp）形成Hp-Hb复合物。通过电泳法将结合的Hp-Hb复合物与未结合的Hb分开，测定Hp-Hb复合物的量，从而得到血清中结合珠蛋白的含量。
参考值 0.5～1.5gHb/L
临床评价
（1）正常情况，血浆中血红蛋白与结合珠蛋白结合形成复合物，在单核-吞噬细胞系统和肝内被消除。溶血时血浆中的血红蛋白与 Hp 结合增多，使血清中结合珠蛋白减少，测定血清中结合珠蛋白的含量可反映溶血的情况。
（2）血清结合珠蛋白减少见于各种贫血，尤其是血管内溶血。严重肝病、先天性无珠蛋白血症、传染性单核细胞增多症等 Hp也明显减低，此时不能以此指标判断有无溶血。
（3）血清结合珠蛋白增高见于感染、创伤、SLE、恶性肿瘤、类固醇治疗、妊娠、胆管堵塞等。此时如Hp正常，不能排除合并溶血的可能。
（四）血浆高铁血红素白蛋白检测
原理 血浆游离血红蛋白可被氧化为高铁血红蛋白，再分解为珠蛋白和高铁血红素，后者先与血中的血红蛋白结合，血红蛋白消耗完后，高铁血红素与白蛋白结合形成高铁血红素白蛋白（methemalbumin），后者与硫化铵形成一个容易识别的铵血色原（ammonium hemochromogen），用光谱仪观察结果，在绿光区558nm处有一最佳吸收区带。
参考值 正常人呈阴性
临床评价
血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白。
（五）尿含铁血黄素试验（Rous试验）
原理 又称Rous试验。当血红蛋白通过肾过滤时，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。尿中所含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，其中的高铁离子（Fe3＋）与亚铁氰化物作用，在酸性环境下产生蓝色的亚铁氰化铁普丹氏蓝色沉淀。尿沉渣肾小管细胞内外可见直径1～3μm的蓝色颗粒。
参考值 正常为阴性
临床评价
Rous试验阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁排出。无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血管内溶血如PNH，本试验结果即呈阳性，并可持续数周。但在溶血初期，虽然有血红蛋白尿，上皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄素，此时本试验可呈阴性反应。
（六）尿卟啉检测
原理 尿中卟啉类物质在酸性条件下，经乙醚提取，于405nm处显红色荧光，从而可对尿卟啉进行定性检测。
参考值 正常为阴性
临床评价
尿卟啉增加，主要见于先天性红细胞生成型卟啉病、迟发性皮肤型卟啉病、肝性红细胞生成型卟啉病等。卟啉类化合物检测对研究血红素代谢障碍有重要意义，除卟啉病外，对缺铁性贫血、铅中毒、铁粒幼细胞贫血和珠蛋白生成障碍性贫血等的诊断有价值。
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