粒细胞检验的方法

第二章　粒细胞检验的方法

一、中性粒细胞功能检查

（一）全血粒细胞天然免疫功能测定

原理　待测新鲜枸橼酸抗凝血，其血浆含有补体成分，将此血浆加入癌细胞悬液中，经孵育后癌细胞可旁路激活补体，黏附补体C分子，再加入自身粒细胞，带有C3b等补体分子的癌细胞可被数量众多的粒细胞补体受体黏附结合形成花环状，花环率的高低可作为粒细胞在血循环中天然免疫力高低变化的指标之一。

参考值　计数一个癌细胞黏附3个或3个以上粒细胞为一朵花环，计数100个癌细胞，算出花环率。

临床应用

血循环中粒细胞是重要的免疫细胞，有多种天然免疫功能。该试验可作为粒细胞天然免疫功能变化的客观指标之一，结合流式细胞仪测定粒细胞CD35、CR3、红细胞CD35、CD44、CD58、CD59、CD55等指标，可用于探讨与红细胞天然免疫功能之间的关系，在基础理论、临床应用、中医药免疫学以及肿瘤免疫学研究中都具有重要的理论和应用价值。

（二）墨汁吞噬试验

原理　血液中中性粒细胞（单核细胞）对细菌、异物等具有吞噬作用。在100μl的肝素抗凝血中，加入10μl的墨汁，在37C孵育4小时，涂片染色镜下观察中性粒细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数。

参考值　成熟中性粒细胞吞噬率44%～104%，吞噬指数6～246。

临床应用

中性粒细胞仅成熟阶段才具有吞噬功能，单核细胞幼稚型和成熟型都具有吞噬能力。急性单核细胞白血病 M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。急性粒细胞白血病（M2）、急性早幼粒细胞白血病（M3）和急性淋巴细胞白血病的白血病细胞吞噬试验为阴性。急性粒-单核细胞白血病呈阳性反应，慢性粒细胞白血病的成熟中性粒细胞吞噬能力明显减低。该试验对鉴别白血病类型有一定价值。

（三）白细胞吞噬功能试验

原理　制备白细胞悬液，将待测的中性粒细胞与葡萄球菌混合，37C温育一定时间后，细菌可被中性粒细胞吞噬。在镜下观察中性粒细胞吞噬细菌的情况，根据吞噬率和吞噬指数即可反映中性粒细胞的吞噬功能。

参考值

① 吞噬率（%）＝吞噬细菌的细胞数/200个中性粒细胞×100%

正常为 60.0%～65.8%

② 吞噬指数=200个中性粒细胞吞噬细菌的总数/200个中性粒细胞

正常为1.1 ～1.0

临床应用

本试验简单可靠，可了解中性粒细胞的吞噬功能。如细菌感染时中性粒细胞吞噬率和吞噬指数增高，对疑有中性粒细胞功能异常综合征或补体所致的调理缺陷症者，有帮助确诊的价值。

（四）血清溶菌酶活性试验

原理　溶菌酶能水解革兰氏阳性球菌细胞壁的乙酰氨基多糖成分，使细胞破裂。用对溶菌酶较敏感的微球菌悬液为作用底物，根据微球菌的溶解程度来检测血清或尿中溶菌酶活性。常用比浊法。

参考值　血清（5～15）mg/L；

　　　　尿（0～2）mg/L

临床应用

本试验对鉴别急性白血病的类型有重要参考价值。人体血清的溶菌酶，主要来自血液的单核细胞和粒细胞，其中以单核细胞含量最多。在中性粒细胞中，从中幼粒到成熟粒细胞可随细胞的成熟程度而增高。淋巴细胞中无此酶。血清和血浆中的溶菌酶大部分是由破碎的白细胞所释放。

1.血清溶菌酶含量增高　可见于部分急性髓性白血病。①急性单核细胞白血病的血清溶菌酶含量明显增高，尿溶菌酶含量也增高。②急性粒—单核细胞白血病血清溶菌酶含量也有明显增高，其增高程度与白细胞总数有关。在治疗前其含量明显高，表示细胞分化程度比好，预后也较好。③急性粒细胞性白血病的血清溶菌酶含量可正常或增高，临床意义与急性粒—单核细胞白血病相似。急性粒细胞性白血和急性单核细胞白血病都是在治疗缓解白细胞减少时，其含量也同时下降，在复发时上升。

2.急性淋巴细胞白血病时多数血清溶菌酶含量减低，少数正常。慢性粒细胞白血病血清溶菌酶含量正常，但急变时下降。

（五）硝基四氮唑蓝还原试验

原理　硝基四氮唑蓝（Nitroblue Tetrazolium，NBT）是一种染料，当被吞入中性粒细胞后，有产生过氧化物酶的作用，可接受葡萄糖中间产物葡萄糖-6-磷酸在磷酸己糖旁路中NADPH氧化脱下的氢，而被还原为非水溶性的蓝黑色甲月替（formazan）颗粒，呈点状或片状沉着在胞浆内有酶活性的部位，可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分比。

参考值　正常成人的阳性细胞数在10%以下。若有10%以上中性粒细胞能还原NBT，即为NBT还原试验阳性；低于10%为阴性。

临床应用

一般认为，中性粒细胞在吞噬杀菌过程中，能量消耗增加，磷酸己糖旁路代谢增强，还原NBT形成甲 月替能力亦因之增强，故此试验可间接研究中性粒细胞杀菌能力。

1.用于中性粒细胞吞噬杀菌功能异常的过筛鉴别和辅助诊断　NBT还原试验阴性见于儿童慢性肉芽肿（chronic granulomatous disease，CGD），葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏症，髓过氧化物酶缺陷症、自身氧化物缺陷和Job综合征（高IgE、A）等。如为可疑CGD时，可用化学方法提取四氮唑蓝作光电比色做定量检查。也可用细菌内毒素激发试验，即取0.5ml肝素抗凝血和10μg细菌内毒素混合后按上述方法试验，如NBT阳性细胞.＞29%即可否定CGD。另外，可用氧电极或华伯仪（warbury apparatrs）测定中性粒细胞吞噬后的耗氧量。正常人耗氧明显，患者不明显。亦可用流式细胞仪通过超氧阴离子的产生以测定氧化酶活性来用于CGD的诊断。

2.用于细菌感染和病毒感染的鉴别　细菌感染时，患者的NBT还原阳性细胞在10%以上，而病毒感染或其他原因发热的患者则在10%以下。

3.器官移植　器官移植后发热，若非细菌感染所致，其NBT还原试验阴性；若该试验阳性，则提示可能有细菌感染。

（六）中性粒细胞杀菌功能测定

原理　将中性粒细胞、细菌（大肠杆菌或葡萄球菌）及调理素按一定比例混合，定时取样培养。计数生长菌落以了解杀菌情况。

参考值　杀菌率计算：

杀菌率（%）=（ 1-作用30、60或90min菌落数/0 min 菌）×100%

中性粒细胞对大肠杆菌杀菌率 ＞90%，对葡萄球菌杀菌率 ＞85%。

临床应用

是判断中性粒细胞杀菌能力的一个指标。

（七）白细胞趋化试验（滤膜渗入法）

原理　在微孔滤膜的一侧放入粒细胞，另一侧放入趋化因子（细菌毒素、补体C3a、C5a等），检测离体粒细胞潜过滤膜到达趋化因子这一侧定向移动的能力。

参考值　趋化指数：3.0～3.5

临床应用

粒细胞有趋化功能，该试验是观察粒细胞向感染处运动能力的一项目重要检测方法。趋化功能缺陷见于Lazy白细胞综合征、Chediak-Higashi综合征、代谢性疾病（糖尿病、尿毒症）、高IgE综合征、感染、白血病及各种皮炎等。当趋化因子生成不足或其抑制因子过多时也出现趋化功能缺陷。

（八）白细胞趋化试验（琼脂糖平板法）

原理　琼脂糖平板中央孔加入中性粒细胞，左侧孔加入趋化因子，右侧孔加入对照液。37C、5%CO₂条件下温育4～8h后，待孔中液干后染色，用显微镜测量细胞从中央孔向左侧孔的移动距离A和向右侧孔移动距离B。

参考值　趋化指数　A／B

临床应用

同滤膜法。

（九）中性粒细胞黏附功能

原理　中性粒细胞有在体外黏附异物的性质，用肝素抗凝血通过尼龙纤维后，计数通过前、后的中性粒细胞数

参考值

正常健康人黏附率为 47%～83% 。

临床应用

是判断中性粒细胞黏附能力的一个指标。

二、粒细胞代谢及产物检验

（一）中性粒细胞碱性磷酸酶染色　见细胞化学染色章

（二）过氧化物酶染色　见细胞化学染色章。

（三）特异性酯酶染色　见细胞化学染色章。

（四）嗜酸粒细胞阳离子蛋白测定（ECP测定）

原理　嗜酸粒细胞颗粒中含有强碱性毒性蛋白，其是细胞毒的主要来源。嗜酸粒细胞活化后释放的强碱蛋白主要有 ECP、MBP（主碱性蛋白）、EPX（嗜酸粒细胞蛋白X）、EPD（嗜酸粒细胞过氧化物酶）。ECP被认为是嗜酸粒细胞特异性标志，可反映嗜酸粒细胞的活化程度。

参考值　免疫萤光法：正常儿童血清含量为0～8.94μg/L，哮喘儿童为0.48～36.00μg/L。

临床应用

患者ECP水平与末梢血中嗜酸粒细胞数无关。ECP水平与疾病的严重程度密切相关。ECP水平可随治疗效果变化，尤其在皮质激素应用后，随着嗜酸粒细胞活化降低，ECP水平也明显降低。测定ECP对过敏性哮喘的诊断、监视及抗炎治疗等均有重要意义。

（五）嗜碱粒细胞脱颗粒试验

原理　嗜碱性粒细胞胞质内的颗粒能被碱性染料（Alcian 蓝）染成蓝色，容易辨认。当嗜碱性粒细胞与过敏原混合一定时间后，过敏原即与结合在细胞上的IgE桥联，产生脱颗粒作用使细胞不再被着色，染色的细胞数明显减少。用患者本身的嗜碱性粒细胞进行试验的称为直接法，用动物嗜碱粒细胞进行试验的称为间接法。试验中用缓冲液代替过敏原作对照。

参考值　加Alcian蓝染液后计数9个大方格内染成蓝色的嗜碱性粒细胞数（F），

计算脱颗粒指数（DI）：

DI（%）＝F对照管/（F对照管－F测定管）×100%

判断结果以DI＞30%为阳性。即嗜碱粒细胞颗粒释放能力增高。

临床应用

是嗜碱粒细胞脱颗粒功能的常做试验。在过敏性疾病或骨髓增殖疾病时，嗜碱粒细胞脱颗粒阳性。

（六）白三烯测定（LTB4测定）

原理　白三烯是花生四烯酸代谢产物，最初在白细胞中发现故名白三烯leukotrine，LT）。粒细胞磷脂中的花生四烯酸在脂氧化酶作用下加氧生成白三烯化合物（LTS），其后再经水解生成稳定的LTB4。

参考值　LTB4（ 45768.02～46559.98）ng／107 中性粒细胞 。

临床应用

LTS具有很强的生物活性，参与体内多种生理生化代谢；并且与临床某些疾病的病理机制密切相关。LT有极强的趋化作用，LTB4为重要的炎症介质，在各种炎症部位含量均增高，在脑血栓、脑损伤、急性心梗时白细胞产生LTB4增加。

（七）中性粒细胞质膜标志酶测定　质膜指中性粒细胞去除胞质中颗粒和细胞核后的完整膜，即为胞质体（cytoplast）。质膜上的各种受体与标志酶与中性粒细胞的功能相关。

1.酸性磷酸酶测定

原理　酸性磷酸酶表达在中性粒细胞质膜内侧，在初级颗粒和核膜上也有表达。在酸性缓冲液中（pH4.8）中，该酶使对硝基苯磷酸（P-NPP）水解为黄色的对硝基苯酚和磷，对硝基苯酚在405nm处有吸收峰，吸光度与酶活性呈正相关。

酶活性计算：活性单位用对硝基苯酚的含量表示。AU＝PNP nmol／（min·mg）Protein

临床应用

多种癌症（子宫、胃、结肠和乳腺癌）患者中性粒细胞酸性磷酸酶活性明显增高。

2.碱性磷酸酶测定

原理　碱性磷酸酶表达在中性粒细胞质膜外侧。在碱性条（pH10）对硝基苯磷酸被该酶水解生成黄色的对硝基苯酚和磷，并在405nm处有吸收峰，吸光度与酶活性呈正相关。

酶活性计算：活性单位用对硝基苯酚的含量表示。

AU＝ PNP nmol/min/mg Protein

临床应用

碱性磷酸酶是一种反映中性粒细胞在循环中和脾中寿命的标志酶。在细菌感染性疾病时其活性增高；但慢性粒细胞性白血病患者中性粒细胞碱性磷酸酶缺失或活性低下。

3. 5＇- 核苷酸酶测定（5＇-NT）

原理　5＇-核苷酸酶不仅是中性粒细胞的标志酶，也是淋巴细胞成熟的标志物。本法用金属离子Ni抑制5＇-核苷酸酶的活性，从不抑制的样品中测出的吸光度（A）值减去Ni抑制的样品的A值，即可从无特异性的磷酸酶中得出5＇-核苷酸酶活性。

酶活性计算　用每分钟每mg蛋白催化ATP释放磷（Pi）的nmol数表示：Pi nmol/mg Pr/min。

临床应用

5＇-核苷酸酶活性随着粒细胞的分化成熟而下降，其在原幼粒细胞膜上表达较多。

三、粒细胞动力学检查

（一）氚标记脱氧胸苷测定

原理　³H-TdR是DNA合成的前期物质，可准确地而稳定地标记细胞核。在粒细胞培养中加入PHA或其他特异性抗原刺激后，使粒细胞进入有丝分裂期。再加入3H-TdR，其可被S期的幼稚粒细胞摄入参与其DNA合成，摄入的量与DNA合成的量及增殖细胞数成正比，用液体闪烁计数器测定3H-TdR的摄入量，可判断粒细胞的增殖水平。

参考值　SI ＜ 2

临床应用

正常时粒细胞在骨髓增殖池、血液循环池及组织边缘池之间处于动态平衡。外周血中粒细胞数约为（2.5～5.5）×10／L。在各种病理情况下，这种平衡受到不同程度的破坏而异常。该试验在对白血病细胞动力学的研究中可证实白血病细胞是一群非同步化的增殖细胞群。

（二）泼尼松刺激试验

原理　正常时骨髓中性粒细胞储备量大于外周血中的粒细胞总量，泼尼松能刺激骨髓中性粒细胞由储备池向外周血释放。如果受检者骨髓粒细胞储备池正常，服用泼尼松后经过一定时间后外周血中性粒细胞的绝对值明显增高。反之，则无此作用或作用不明显。

参考值　服药后中性粒细胞最高绝对值＞20×10⁹/L（服药后5h为中性粒细胞上升到高峰的时间）。

临床应用

本方法操作方便，结果可靠，间接但准确地反映骨髓中粒细胞的储备功能。中性粒细胞减少患者，如服用泼尼松后外周血中性粒细胞最高绝对值 ＞ 20×10⁹/L，说明患者骨髓中性粒细胞的储备池正常，粒细胞减少非骨髓粒细胞生成所致而可能是骨髓释放障碍或其他原因引起。该试验对于某些骨髓受损引起的轻度粒细胞减少有一定参考及诊断价值。反之，则反映储备不足。

（三）肾上腺素激发试验

原理　中性粒细胞进入血流后，约半数进入循环池；半数黏附于血管壁构成边缘池，此部分粒细胞在外周血不被计数。注射肾上腺素后血管收缩，黏附于血管壁上的粒细胞脱落，从边缘池进入循环池，致外周血粒细胞数增高。

参考值　粒细胞上升值一般低于（1.5～2.0）×10⁹/L

临床应用

本试验操作简单，可用于鉴别粒细胞减少症是否为“假性”减少。注射肾上腺素后，如外周血白细胞能较注射前增加1倍以上或粒细胞上升值一般超过（1.5～2.0）×10⁹/L，说明患者边缘池粒细胞增多，属粒细胞分布异常，如无脾大，可考虑“假性”粒细胞减少。如果增高低于上述值，须进一步确定粒细胞减少原因。

（四）二异丙酯氟磷酸盐标记检测

原理 利用含有放射性磷的二异丙酯氟磷酸盐（diisopropyl fluorophosphate，DF ³²P）作为胆碱酯酶的抑制剂，其能与粒细胞膜上的胆碱酯酶结合。结合了DF ³²P的粒细胞在体内破坏后，其结合的DF P也不再被利用，即不再与其他细胞结合。作粒细胞动力学检测时，采血即制成标记物，立刻静脉注射。经过一段时间再次采血，分离粒细胞，通过追踪观察其放射活性的变化，可测知外周血中有关粒细胞的参数。

参考值

粒细胞总数的测定：标记粒细胞半衰期（T1/2）：4～10小时；血中滞留时间：10～14小时。

全血粒细胞池（total blood granulocyte pool，TBGP）：35～70×10⁷/kg

循环粒细胞池（circulation granulocyte pool，CGP）：20～30×10⁷/kg

边缘粒细胞池（marginal granulocyte pool，MGP）：15～40×10⁷/kg

粒细胞周转率（granulocyte turnover rate，GTR）：60～160×10⁷/（kg · d）

临床应用

本方法操作比较麻烦，但结果可靠。可以在体外及体内标记粒细胞以观察骨髓中细胞增殖情况。静脉注射可以测定骨髓细胞转移时间，中性粒细胞储备池及骨髓中幼稚粒细胞转换率等。

（五）流式细胞仪检测DNA合成及含量

流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是流式细胞分析所需要的仪器。流式细胞技术是集计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞免疫萤光技术、单克隆抗体技术的高新细胞分析技术，其对单细胞快速定量分析和分选。 被测标本（如粒细胞）经特异性荧光染料染色后制成单细胞悬液加入样品管中，在气体的压力推动下进入流动室。细胞排成单列，逐个匀速通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后产生散射光并发出荧光，荧光转化为电子信号经过特殊的计算机软件储存、处理后，快速而准确地获得形态学、生物化学、免疫学等多种参数（DNA、RNA、蛋白质、细胞体积、抗原等），从而实现了细胞的定量分析和分选。

1.DNA合成的检测

原理　用5-溴脱氧脲嘧啶（5-bromodeoxyurine，5-BrdU）掺入S期细胞的DNA，然后用抗5-BrdU抗原的特异性抗体，通过免疫荧光技术，用FCM准确测定细胞的DNA合成速率。

结果　精确测定大量细胞的DNA含量，准确区分G1、S、G2+M细胞周期各时相分布的动态参数，间接了解DNA的合成情况。

临床应用

协助临床上制定最佳治疗方案。化疗药物主要作用于增殖期（S、G2 、M）肿瘤细胞，这样可将G0期细胞诱导进入增殖期，再予以细胞杀伤药物，达到最佳杀伤肿瘤细胞的治疗效果。

2.DNA含量的测定

原理　用荧光染料碘化丙啶（propidiu miodide，PI）与双链DNA分子特异性结合。DNA 的含量与荧光染料的结合量成正比。经PI 染色的 DNA 分子在激光激发下产生红色荧光，利用FCM将细胞按不同的荧光强度即DNA含量分类并绘出DNA直方图，从DNA直方图中可作细胞周期分析。

结果　DNA含量随着细胞的增殖周期不同而有差异。如果将G0/G1期DNA含量看成 2C，则 G2/M 期应为 4C，S 期在2C～4C 之间。DNA 直方图上第一个峰表示G0/G1期，第二个峰表示G2/M期，两峰之间是S期。

（1）细胞DNA含量：一个细胞群中DNA含量用DNA指数（DNA index，DI）来表示相对含量。根据 DI 值来判断细胞 DNA 倍体的方法是：以正常同源组织细胞作为样品2C（2 componets）DNA 含量细胞的内参标准。DNA 倍体的判断标准为DI = 0.1±2CV。二倍体（diploid）∶DI = 1.0±2CV（直方图上仅1个G0/G1峰）。非整倍体（aneuplid，AN）∶DI值＜0.91，＞1.10。样品G0 / G1 期DNA 量平均数DNA指数（DI）=标准二倍体DNA量平均数

（2）细胞周期各时相细胞的相对数量：包括：G0/G1 期、S 期和 G2-M 期，计算各时相细胞的百分比。S期细胞的百分比也叫SPF（S-phase fraction）。

SPF（%）= [ S（G0/G1 + S + G2M）]×100%

细胞增殖指数（PI）（%）=　S + G2-M/G0/G1 + S +（G2-M）×100%

临床应用

细胞周期分析对急性白血病的治疗和预后都有一定的意义：① 正常细胞 DNA 为二倍体（2C），肿瘤细胞DNA为的非整倍体，从DNA含量分析可了解髓系白血病细胞的倍体水平和增殖活动。② 根据 DNA 直方图，白血病患者在非治疗时其白血病细胞G1-S期有阻滞，细胞DNA百分含量明显低于正常骨髓细胞，但治疗后好转。S + G2-M期低的患者提示有较长的生存期；S + G2-M期高者常早期死亡，协助判断预后情况。③SPF 高者对周期特异性药物比较敏感，从而可指导临床用药，诱导静止期白血病细胞进入S期，以提高化疗效果。

（六）粒细胞抗体检测

1.荧光免疫法

原理　在正常人粒细胞悬液中加入受检血清，如血清中有粒细胞抗体，便与正常人粒细胞结合，再加入标记有萤光物质的兔（羊）抗人免疫球蛋白，可与粒细胞膜结合而显示萤光。

参考值　正常时血清阴性，有阳性反应表示受检血清中有粒细胞抗体。

临床应用

本方法敏感性较好，特异性强。临床上常作为确诊免疫性 粒细胞减少的试验。血清粒细胞抗体常见于系统性红斑狼疮、Felty综合征及其他自身免疫性疾病。

2.化学发光法

原理　用化学发光技术测定单个核细胞与抗体被覆的粒细胞相互作用产生的代谢反应。间接测定抗粒细胞抗体。

参考值　用发光仪测定增强的化学发光反应，用发光指数表示结果。

临床评价

本法比间接萤光免疫法高敏感，可用于确诊免疫性粒细胞减少症。

3.流式细胞技术检测

原理　用正常人“O”型抗凝血分离出单核细胞和粒细胞，经1%多聚甲醛固定，二者再等量混合制成细胞悬液，加受检血清孵育，再加结合异流氰酸荧光素（fluoresion isothiocyanate，FITC）和抗人F（ab）2IgG，，采用流式细胞分析仪进行分析来检测同种反应性粒细胞抗体。

参考值　荧光强度与粒细胞抗体量呈线性关系，根据萤光强度的大小即可得到粒细胞抗体的量。

临床应用

本法可对粒细胞抗体作半定量测定及抗体类型的分析，以确定是否存在免疫复合物。

4.白细胞抗人球蛋白消耗试验

原理　在受检血的粒细胞悬液中加入抗人球蛋白抗体，如粒细胞膜上吸附有不完全抗体，则加入的抗人球蛋白抗体即与之结合而被消耗。观察抗人球蛋白效价在接触受检粒细胞前、后的变化，可间接证明受检血清中是否有不完全抗体。该试验有直接法和间接法。

参考值　如测定组效价低于标准对照组2管或2管以上为阳性，表明受检血清中有不完全抗粒细胞抗体。正常对照和盐水对照组应无消耗。

临床应用

可间接测定受检者血清或粒细胞表面存在不完全抗体。阳性反应见于免疫性粒细胞减少症、同种输血反应、多次输血或SLE等。

四、粒细胞免疫标记检测

免疫标记存在于细胞表面或胞质内，其代表某一细胞种类或某一亚群，如表面受体、分化抗原等。粒细胞在其成熟过程中抗原的表达大致分为五个阶段。第一阶段骨髓粒细胞表达CD34和HLA-DR，CD13和CD33呈高水平表达。第二阶段骨髓粒细胞CD34和HLA-DR消失；CD33 降低，CD15 表达增强。第三阶段骨髓粒细胞 CD11b中等水平表达；CD13消失。第四阶段骨髓粒细胞CD13再次表达并与CD16呈平行性上升；CD33呈去轻度下降。第五阶段骨髓粒细胞抗原表达与外周血粒细胞相同，即CD13、CD16、CD11b、CD45都表达并达最高水平。粒细胞免疫标记检测有免疫细胞化学法、免疫荧光技术及流式细胞术，现在国际上公认流式细胞术。

（一）荧光显微镜计数检测

原理　利用荧光素把抗体蛋白标记为荧光抗体。此荧光抗体与细胞表面的分化抗原相结合后在荧光显微镜特定激发光的照射下发出荧光，成为可见的圆形物。有明显荧光的就有相应的抗原存在。以此对细胞表面标志作出鉴定和定位。荧光抗体法有直接法、间接法及双标记法。

结果　用+号表示荧光强度：无荧光（－）、可疑荧光（±）、荧光清楚可见（+）、荧光明亮（++）、荧光闪亮（+++）～（++++）。

荧光阳性细胞计算：阳性细胞率＝荧光阳性细胞/（荧光阳性细胞+荧光阳性细胞）×100%

临床应用

见生物素-亲和素酶标法。

（二）流式细胞仪计数检测

原理　将细胞标本用荧光标记制成悬液，一般常用直接三色荧光染色，使荧光标记的细胞逐个通过仪器的测量区，分别辨认细胞形态大小和荧光特征，此称为荧光活化细胞分选法（flow cytomatric cell sorting，FACS）。流式细胞仪在短时间内可测量数万个细胞的荧光参数，用计算机记录处理后快速对各个细胞进行多参数定量分析。

结果　流式细胞仪的数据显示通常以一维单参数直方图（histogram）、二维点阵图、二维等高图（contour）或假三维图（pseudo 3D）来表示。单参数直方图是一维数据应用最多的图形，可用来定性和定量分析。

临床应用

见生物素-亲和素法

（三）碱性磷酸酶-抗-碱性磷酸酶桥联酶标法

原理　碱性磷酸酶-抗-碱性磷酸酶桥联酶标（alkaline phosphase antialkaline phosphatase，APAAP）法，是以牛肠碱性磷酸酶作为抗原免疫小鼠，制备小鼠杂交瘤抗碱性磷酸酶单克隆抗体，再与碱性磷酸酶结合，形成APAAP复合物。以小鼠杂交瘤单克隆抗体为第一抗体，兔抗-鼠免疫球蛋白为第二抗体（桥），APAAP复合物为第三抗体。通过碱性磷酸酶水解底物显色，达到抗原定位。

结果　高倍镜下计数 200 个有核细胞，其中细胞膜上或胞质内显示红色标记物为阳性，无红色标记物为阴性。计算各片阳性细胞百分率，该百分率即分别代表各单抗所指向抗原的阳性百分率。阳性细胞 ≥20%为阳性结果。

临床评价

见生物素-亲和素法

（四）生物素-亲和素酶标法

原理　在生物素-亲和素酶标（avitin-biotin-peroxidase complex，ABC）法中生物素先与辣根过氧化物酶偶联，再与亲和素结合，形成亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物，即ABC。细胞抗原与特异性抗体（第一抗体）结合后，再与已标记上生物素的第二抗体起反应，又与ABC结合。ABC上辣根过氧化物酶作用于显色剂，使其产生有色沉淀，确定抗原存在部位。

结果　计数方法同APAAP。

临床应用

抗人白细胞分化抗原CD系列单克隆抗体与流式细胞仪和多色荧光染料的联合应用，已是临床医学研究的重要方法，其促进了血液学和免疫学的发展由于白细胞分化停滞于某一阶段及克隆性异常增殖的结果，形成白血病的不同亚型。髓系白血病（M0～M5）的白细胞分化到不同阶段出现不同的细胞表面标记，由此可以对其进行免疫分型。但由于尚缺乏特异性髓系细胞分化抗原的单抗，也就是缺乏特异性的ANLL亚型免疫标志，所以，免疫标志应用在ANLL的分型尚在探讨之中。但白血病细胞仍然能够表达正常粒细胞的抗原，如：CD33、CD13、CD14、CD11、CD64等。髓系白血病细胞出现的常见抗原是：CD13、CD33、CD14、CD15、CD68、MPO等。目前对髓系白血病免疫分型常用的抗原是CD13、CD33、CD15、CD45、HLA-DR、CD34、CD7、CD3及抗髓过氧化物酶（MPO），MPO对髓系白血病M0～M5的诊断具有重要价值。CD45是白细胞的共同抗原，其细胞表面的表达量与细胞的分化程度有关，原、幼细胞的表达量比成熟细胞低，由此可鉴别出原、幼细胞的数量，再结合其他免疫标志共同分析有利于白血病亚型的正确诊断。在急白M0型时至少表达一个髓系抗原，MPO比CD13、CD33更敏感。CD13在原始粒细胞胞质内表达比膜上早，这在急性髓性白血病（AML）的诊断上有重要意义；相当一部分急性白血病M2患者表达CD15；约90%的AML白血病细胞表达CD117。急性白血病时，粒（髓）细胞免疫标志应用其亚性的鉴别有尤其是对 M0 型的诊断；此外，应用于与急性淋巴细胞白血病鉴别及急性双表型白血病的诊断。