淋巴细胞及浆细胞检查

第三节　淋巴细胞及浆细胞检查

一、形态学检查

（见本章第一节）

二、组织化学检查

（一）酸性α－醋酸酯酶检测

原理　血细胞中的酸性α－醋酸酯酶（α-acid naphthyl acetate esterase， ANAE），在弱酸性（pH 5.8）条件下能将基质液中的α－醋酸萘酯水解，产生α－萘酚。产生的α－萘酯酚再与六偶氮副品红偶联形成不溶性暗红色偶氮副品红萘酚沉淀，定位于胞质内酶活性处，呈现单一的或散在的红色点块状或颗粒状。

结果　酸性α－醋酸酯酶（ANAE）主要分布在T淋巴细胞和单核细胞内； 粒细胞，B淋巴细胞，红系细胞，巨核细胞和血小板中含量较少。 T细胞为ANAE阳性细胞，胞质内有大小不等、数量不一的紫红色颗粒或斑块；B细胞为ANAE阴性细胞，胞质呈黄绿色，胞质内无红色斑块；单核细胞为ANAE阳性，其胞质内有细小红褐色颗粒斑块。

临床应用

（1）有助于区分T淋巴细胞和B淋巴细胞：ANAE染色在T淋巴细胞胞质中呈现点状颗粒或大块局限阳性反应；B淋巴细胞大多数为阴性反应，偶见稀疏弥散细小颗粒。

（2）鉴别急性白血病类型：急性T淋巴细胞白血病细胞为点状或块状阳性，局限分布；急性粒细胞白血病细胞ANAE染色大部分呈阴性或弱阳性反应，颗粒增多的早幼粒白血病细胞阳性反应较强，为弥散性分布；急单呈强阳性反应，胞质为均匀一致的弥散样淡红色或深红色，无点状颗粒。

（二）过碘酸—雪夫（Periodic acid–Schiff，PAS）染色

原理　胞浆内存在糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）的乙二醇基（CHOH－CHOH）经过碘酸（Periodic acid）氧化，转变为二醛基（CHO－CHO），与雪夫（Schiff）试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于胞浆中。该反应称为过碘酸-雪夫（PAS）阳性反应。经淀粉酶消化处理以后，如为糖原，PAS阳性物质即可消失，反应即转阴，如不转阴，即为PAS阳性而不应称糖原阳性。

结果　PAS 在胞浆内为红色阳性物，呈弥散状、颗粒状或块状。胞浆内无色或无颗粒为阴性。可用阳性率报告结果，并说明阳性物的形态。

临床应用

鉴别淋巴系统增生性质　凡恶性增生时PAS反应多呈强阳性反应，阳性反应见于急、慢性白血病，淋巴瘤等。

（三）酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色　显示酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）的染色方法有硫化铅法和偶氮耦联法两种。现介绍偶氮耦联法。

原理　血细胞内的酸性磷酸酶在酸性条件 下，将基质中的磷酸萘酚 AS-BI 水解，释出萘酚AS-BI，再与重氮盐偶联，形成不溶性有色沉淀，定位于胞浆中。

结果　阳性反应为鲜红或深红色颗粒，定位于胞浆。根据颗粒多少和染色的深浅将反应强度分为六级。

临床评价

酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色仅在基质缓冲液中有无 L-酒石酸而异，它们的意义在于：

1.帮助诊断多毛细胞白血病　多毛细胞白血病的毛细胞中，酸性磷酸酶（ACP）染色呈阳性，且不被L-酒石酸抑制，故缓冲液中加入L-酒石酸仍为阳性。淋巴瘤细胞和慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞 ACP 染色也可呈阳性反应，但可被L-酒石酸所抑制。

2.辅助鉴别T和B细胞　前者ACP染色呈阳性，而后者呈阴性反应。在抗酒石酸染色时都为阴性或极少数表现为弱阳性。

3.正常粒系细胞、单核吞噬系细胞和巨核细胞ACP染色为阳性，但抗酒石酸染色均为阴性。

4.帮助鉴别戈-谢细胞和尼曼-匹克细胞，前者ACP染色为阳性，后者为阴性反应。

三、免疫学检查

（一）淋巴细胞免疫标志检查

1.检查方法　有免疫荧光法和免疫酶法二种：

（1）免疫荧光法：分离血液或骨髓中的单个核细胞，用间接免疫荧光法检测其特定的抗原，即用相应的单克隆抗体作第一抗体，与白血病相应抗原作用后，再加羊抗鼠免疫球蛋白荧光标记抗体（第二抗体），作用一定时间后，然后用荧光显微镜观察或流式细胞仪分析。

（2）免疫酶标法：可直接用于血液或骨髓涂片，亦可分离单个核细胞涂片。

有三种方法：①过氧化物酶－抗过氧化物酶（PAP）法 单克隆抗体与白血病抗原作用后，再加羊抗鼠第二抗体连接单克隆抗体和PAP复合物（鼠抗过氧物酶抗体为第三抗体），加底物显色和苏木素或甲基绿复染后光镜下观察，同时可见细胞②碱性磷酸酶－抗碱性磷酸酶（APAAP）法；用APAAP复合物代替上法的PAP复合物，可避免白细胞内源性过氧化物酶的干扰。③生物素一亲和素酶标法（avitin-biotin-peroxidase complex，ABC）。

2.临床应用

（1）T细胞及其亚群：T祖细胞（pro-T）的表型为CD34⁺、TdT⁺、CD10⁺ 、CD7⁺、未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞表面标志需经历一定的变化过程：从CD7⁺、CD2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-→CD7⁺、CD2⁺、CD3⁺、CD4-、CD8-、TCR-（即CD4、CD8 双阴性）→CD7⁺、CD1⁺、CD2⁺、CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、TCR⁺（即CD4、CD8双阳性），最后发育成CD7⁺、CD2⁺、CD3⁺、CD4⁺、CD8-、TCR⁺和 CD7⁺、CD2⁺、CD3⁺、CD4-、CD8⁺、TCR⁺单阳性的两群成熟胸腺细胞，然后进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能。但在正常外周血中通常存在CD3⁺ 、CD4⁺、CD8-（TH/TI），CD3⁺、CD4-、CD8⁺（TS/TC），CD3⁺　CD4⁺　CD8⁺和CD3⁺ CD4 -　CD8 -四种表型不同的T细胞，它们分别占T细胞总数的60%～70%，20%～30%，1%～3%，1%～10%。前三种表型细胞的TCR主要为TCRαβ，而CD4- CD8- T细胞主要表达TCRγδ，他们都执行细胞免疫功能。

T淋巴细胞系免疫标记：m/CyCD3、m/CyTCRα、mTCRβ、cTCRγ/δ、CD2、CD5、CD8、CD7、CD1a、CD4 。①骨髓：免疫干细胞分化抗原：TdT，HLA-DR；前胸腺细胞分化抗原：TdT、CD7、CyCD3、CD5。②胸腺：未成熟胸腺细胞（immature thymocyte）表达TdT、CyCD3、CD38、CD5、CD2、CD7；普通胸腺细胞（common thymocyte）表达TdT、CD38、CD7、CD3、CD5、CD2、CD1、CD4、CD8；成熟胸腺细胞（mature thymocyte）表达抗原除 CD1消失外，与普通胸腺细胞基本一致。③外周淋巴组织：主要有 T辅助细胞（TH）、T抑制细胞（TS）、效应T细胞（TC）和激活TH （aTH）、激活TS （aTS）亚群组成。其分化抗原为 CD3（PanT）、CD4（TH）、CD8、（Tc/Ts）。a TH 和 aTS还表达TdT与细胞分化阶段相应的细胞分化抗原。

T细胞亚群检测：用CD4和CD8单抗可将外周淋巴器官和血液中的T细胞分为CD4⁺、CD8^-（TH）和CD4^-、CD8⁺（Ts）两个主要亚群。临床上常用测定全 T（CD3）、TH （CD4）、（CD8）以及计算 TH / Ts（CD4/ CD8）比值作为机体免疫状态，某些疾病诊断、病期分析，监测治疗和判断预后的参数。外周血单个核细胞中 CD3⁺（T3）细胞为60%～80%，CD4⁺（T4）为 45%～55%，CD8⁺（T8）为 20%～35%。CD4/ CD8比值为1.3～2.0，CD3、CD4细胞数量减少及功能降低，CD8数量增多，CD4/ CD8比值减少或倒置，见于多种感染（尤其是病毒感染）、肿瘤、免疫缺陷病、再生障碍性贫血、粒细胞减少症等免疫功能降低的疾病。疾病恢复期，CD4/CD8可转为正常，在某些自身免疫性疾病的活动期，如系统性红斑狼疮等可增高。器官移植和骨髓移植时，可用 CD4/ CD8 之比作为排斥检测的指标，比值增高，提示有排斥反应

（2）B细胞：B细胞的分化主要分为B祖细胞、前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞6个阶段。①B祖细胞（pro-B） 此期最早识别的B细胞特异性抗原是CD19，同时表达CD34、细胞核TdT、HLA-DR、CD40、cyCD22。②前 B 细胞（pre-B） CD34 和 TdT 消失，出现cyCD79、CD10、CD20、CD9、CDw78、CD74+，cμ（胞浆IgM重链）。③未成熟（早期）B 细胞（immature B cell） CD9、CD10 消失，出现 SIgM、CD22、CD20、CD24、CD40、CD72、CD74、CDw78、CD79表达增加。其他新的 B抗原 CD37、CD2、CDw75、CDw76相继出现。④成熟 B 细胞（mature B cell）　SmIgM和 IgD 同时表达，并出现 CR、FcR和丝裂原受体，上述B细胞抗原继续存在。⑤活化B细胞（activated B cell）　成熟B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞，继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激活抗原CD23、CD77、CD80、CD86 和其他激活相关抗原如 CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、CD71、CD38 等。膜结合型 Ig 逐渐减少，分泌型 Ig 逐渐增加，并可发现 Ig基因重链类型转换。⑥浆细胞（plasma cell）激活B细胞进一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表达增加，CD38抗原再出现。而SmIg和上述B抗原消失。CD79仍可存在于胞质中。 故 B细胞上的CD抗原分为：①B细胞限制性（特异性）抗原：CD19、CD20、CD21、CD22、CD77和CD79， 它们的表达只限于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。②B细胞相关性抗原：CD5、CD9、CD10、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CDw78、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。而B细胞表面的受体SmIg，是B细胞特异性识别抗原的受体，也是B细胞重要的特征标志。

B淋巴细胞系　m/cy CD22、cyCD79、Cyμ、sIg、CD19、CD20、CD10、CD22、CD24、TdT，其中胞质内重链（Cyμ）是前 B 细胞（Pre-B）的特异性标记。后出现 Igκ轻链及λ轻链（晚于κ）。CD19的反应谱广，从早前B细胞至前浆细胞，是鉴别全B系的敏感而特异的标记。CD10又称普通急性淋巴细胞白血病抗原 （commom acute lymphocytic leukemia antigen，CALLA），为诊断Common-ALL的必需标记。

随B细胞分化成熟依次表达CD20、CD21、CD22。胞浆CD22（CyCD22）先于膜表达，且出现很早，用于检测早期B细胞来源的急性白血病是相当特异而敏感的。 浆细胞表达CyIg⁺、浆细胞抗原PC-1⁺、PCA-1⁺。

（二）末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）检测

1.同位素检测法

原理　以 H或 C 标记的脱氧腺苷三磷酸等的 dXTP 为基质，用低聚脱氧核苷（dA）等人工同聚物作为引物，由于酶反应与引物重合，使基质不溶于三氯醋酸，可用玻璃纤维盘将其吸附，从未被放射性同位素标记的反应基质中分离出反应的生成物，计测放射活性。除不加引物所测定的内源性反应所引起的活性之后，可测算酶的活性。

参考值　正常人骨髓细胞的活性为dGTP 掺入 1×10 8个细胞的量为 0～0.09mmol/L。

临床应用

（1）急性淋巴细胞白血病（T、B、非 B型）可检出较高的 TdT 活性，慢性粒细胞性白血病急性变时，约有1/3的病例在原始细胞中能检出高活性的TdT。

（2）恶性淋巴瘤中，原淋巴细胞性淋巴瘤的淋巴结细胞中能检出高的 TdT活性。

（3）此酶检查在研究造血细胞的分化与白血病的关系、白血病细胞的起源、白血病的治疗药物选择上都有较重要的价值。

2.酶标免疫细胞化学显示法

原理　末端脱氧核糖核酸转移酶（terminal　deoxynucleotidyl transferase，TdT）是一种 DNA聚合酶，它不需要模板的指导，就可以催化细胞的脱氧核苷酸，使其转移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3′-OH端，合成单链DNA。兔抗牛TdT抗体能和人细胞的TdT产生交叉反应，可采用免疫荧光技术或酶标免疫细胞化学技术用辣根过氧化物酶-抗酶复合物（PAP immuncomplex）在细胞涂片上定位，显示细胞内的TdT。

结果　阳性反应为棕黄色颗粒，定位在细胞核上。TdT为早期T淋巴细胞的标志，在正常情况下不成熟的胸腺淋巴细胞出现阳性反应，正常人外周血细胞中极少或无活性。

临床应用　95%以上急性淋巴细胞白血病和大约 30%慢性粒细胞白血病急淋变患者外周血细胞有明显的TdT活力，病情缓解后阳性率逐渐减弱。在急性淋巴细胞白血病中，由于细胞表面标志不同，TdT 活性也有变化，T-ALL，non T-ALL，non B-ALL 细胞的阳性率很高。B-ALL 细胞阴性。当外周血中此酶活性升高，就预示着血细胞的恶性变。因此TdT的测定对急性白血病的鉴别和治疗都有一定意义。

（三）N-碱性磷酸酶（N-Apase）检测

原理　用 P-硝基酚磷酸盐（P-NPP）作为细胞碱性磷酸酶（APase）总活性检测的基质，在反应中生成 P-硝基酚，测量 400nm 时的吸光密度，借以检测出细胞A-Pase的总活性。此外，可通过CASP作为基质来测定N-Apase的活性。通过酶反应，生成半胱胺，这是用二硝基苯（DNTB）置换5－硫－硝基酚酸；检测412nm的吸光密度，借以检测N-APase的总活性。在基质液中加入用N－丁醇 : 水（1 : 3）的混合液提取粗酶液，室温下放置60min，记录酶反应，求出酶反应的速度。一般情况下，N-APase的P-NPP与CASP的水解速度之比（VP-NPP/VCASP）在1.1～2.0的范围内，平均为 1.8。因此，N-APase 的活性可用 VP-NPP-1.8VCASP求出，再从（VP-NPP-1.8VCASP）VP-NPP计算N-APase的百分率。

参考值　正常人的粒细胞、淋巴细胞中不能检出N-APase的活性。

临床应用

此酶是从未成熟的白血病性原始淋巴细胞向T细胞、B细胞分化过程中，未成熟的淋巴系统的细胞标志酶。ALL和CML急淋变时，原始淋巴细胞能检出 N-APase，且不仅在非 T-ALL、非 B-ALL 的幼稚细胞，就是在 T-ALL 及具有 B 细胞标记物的原始细胞中亦可检出。因此，认为此外，在鼻咽癌、喉癌等被认为是病毒感染的肿瘤细胞中，以及与 EB 病毒有关的传染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤等，均可检出此酶。