射线对肿瘤细胞周期再分布的影响

第三节　射线对肿瘤细胞周期再分布的影响

恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一。目前研究认为:肿瘤的发生发展经过起始、启动、促进和癌变几个阶段逐步演化，并经历多个癌基因和抑癌基因的基因改变，如点突变、易位重排、基因扩增等，最终导致基因表达调控异常和细胞恶性增生。目前已发现了100多个癌基因和抑癌基因。大量的研究表明，绝大多数的癌基因和抑癌基因并不直接引起肿瘤的发生，并且其所编码的蛋白存在于细胞的各个组成部分中，包括细胞核、细胞质、线粒体和细胞膜，它们处于信号通路中的不同部位，参与细胞周期的调控，保证细胞周期调控因子在细胞周期检测点的控制下，有序地启动和完成细胞周期的循环；若细胞周期调控失常，可导致细胞的异常增殖而使肿瘤发生；并且已经发现绝大多数肿瘤细胞存在若干细胞周期调控基因的改变，因此，可以说肿瘤是一类与细胞周期相关的疾病。

放疗是恶性肿瘤的主要治疗方法之一。在放疗的过程中，辐射能够直接对细胞分裂周期和细胞群的增殖动力学产生影响。从细胞和分子水平研究肿瘤受照射后细胞周期的变化规律，并深入了解这些变化对于肿瘤细胞存活的实际意义，有助于我们认识肿瘤对放疗的抗拒机制，从而制订行之有效的放射增敏策略。

一、细胞周期的正常运行

细胞周期分为G1、S、G2和M 4个时期。G1期为完成必要的生长和物质准备，S期完成染色体DNA的复制，G2期进行必要的检查及修复以保证DNA复制的准确性，然后在M期将遗传物质均等分配到子细胞中。细胞周期只有在精确的调控机制下才能保证其有条不紊地依次进行。

研究发现细胞周期调控的主要蛋白分子包括Cyclins（细胞周期素）、CDK（Cyclin－dependent kinase，细胞周期素依赖性蛋白激酶）、CDKI（CDK inhibitor，CDK抑制因子）和CAK（CDK－activating kinase，CDK激活性蛋白激酶）等。Cyclins是在细胞周期中起调控作用的蛋白质，且Cyclins只有与CDK蛋白形成复合物，才能使CDK发挥激酶活性，并对特定的蛋白质基团进行磷酸化，进而影响其下游的作用底物，从而实现其调节功能。CKI具有抑制CDK活性的功能，当CKI与CDK/Cyclins复合蛋白相结合时，可以导致复合体失活，不能进行下游底物的调节。

不同分子的Cyclins和CDK与CDKI及CAK等蛋白可以精确地调控细胞周期的每一个时相。在G1期主要由Cyclin D1、2－CDK4、Cyclin D3－CDK6和Cyclin E－CDK2来进行调控。若细胞增殖条件允许，CDK可激活pRb蛋白，使其处于高磷酸化状态，进而释放大量的转录因子（特别是E2F）作用于多个基因产生多种细胞周期性蛋白，为S期的DNA复制作准备。不同的细胞G1期长短差距较大，主要取决于细胞外信号和细胞本身的组织学特性。研究表明细胞处于G1早期，则对放射抗拒，G1末期对射线较为敏感。

S期的调控相对较少，但是细胞DNA复制一旦开始，就将一直持续，直至复制结束后才会结束，S期的任务是精确复制超过30亿个碱基的基因组序列，并且每一DNA序列在细胞周期中只被复制一次。在S期主要由CyclinA－CDK2、CyclinH－CDK7来控制，为有丝分裂作准备。研究证实处于此期的细胞对射线最抗拒。

细胞在S期完成DNA复制后，进入G2期，为M期做准备。研究表明处于此期的细胞对射线最敏感。细胞由G2期进入有丝分裂必须由MPF复合物激活；MPF复合物由Cyclin B1和CDC2组成，Cyclin B1和CDC2分别是经典的Cyclins和CDK1，Cyclin B1起调节作用，CDC2起催化作用。

Cyclin B1在S期开始生成并逐渐增加，在G2期末达到最大值，并且Cyclin B1蛋白水平也由磷酸化、泛素化而降解等来调节，这样才能够保证细胞周期的严密进行。Cyclin B1有Ser126、Ser128、Ser133和Ser147四个磷酸化位点，主要作用是在G2/M检测点转移Cyclin B1进入细胞核内。有研究证明，Cyclin B1磷酸化是CDC25去磷酸化CDC2Tyr15的必要环节，并且CDC2/Cyclin B1自身也能使Cyclin B1Ser126和Ser128位点磷酸化。

所有真核细胞进入M期都是由CDC2蛋白激酶的活化来调节。CDC2蛋白是裂殖酵母CDC2基因编码的蛋白，分子量为34kDa，所以又称为P34CDC2蛋白。CDC2蛋白的活化由几个步骤来完成，这包括与Cyclin B1的结合及其Thr161的磷酸化等。然而，细胞由G2期进入M期最关键的一步是激活CDC2，也就是CDC2Tyr15和Thr14基团的去磷酸化。在S期和G2期，CDC2由Weel和Myt1蛋白激酶激活其Tyr15/Thr14基团处于磷酸化状态，该磷酸化抑制CDC2的活性；在G2期末，CDC2Tyr15基团由CDC25磷酸化酶激活而去磷酸化，使其活化。也就是说Weel和CDC25分别表现为抑制和促进CDC2的活性。CDC2的活化需要其Thr161的磷酸化，主要作用是转移胞质的MPF复合物进入胞核，并使其积聚于胞核，为细胞进入M期作准备；此磷酸化在CAK（CDK activating kinase，主要由CDK7和Cyclin H组成）的作用下完成的。CDC2的作用底物包括泛素B、组蛋白H1、核仁素、RNA多聚酶Ⅱ、Cyclin B、SV大T等。

CDC25是一种蛋白磷酸酯酶，主要是使CDC2Tyr15去磷酸化从而激活CDC2，这是细胞进入M期最为关键的一步。CDC25Ser216位点在细胞间期由c－TAK1来磷酸化，但是这种磷酸化是发生在DNA受损之后。Ser216位点磷酸化的CDC25C蛋白与14－3－3家族蛋白结合，从而使CDC25蛋白锚定于胞质内，阻止其进入细胞核激活MPF，抑制细胞期前分裂。DNA受损后，Chk1和Chk2激酶可使CDC25Ser216磷酸化。

总之，在G2末期，CDC25被两种激酶激活，一是polo激酶，另一个是CDC2本身。然后CDC2Thr14和Tyr15在CDC25磷酸酯酶的作用下突然去磷酸化，激活CDC2。激活的CDC2还可以抑制它的抑制因子Weel的活性，形成一个反馈环。因此只要有少量的CDC2被CDC25或polo激活，立即就会有大量的CDC2被活化。激活的CDC2能磷酸化CDC25C来促进CDC2的活化，进而形成一个CDC2/CDC25C自动连锁式反馈环，导致了Cyclin B1和CDC2的复合物在激酶活性上突然爆发式的增加。Cyclin B₁引导CDC2在M期启动时到达相应的底物发挥激酶的作用，从而驱动细胞进入并通过M期，从而完成一个细胞周期。

二、细胞周期的阻滞机制

为保证细胞周期精确循环进行，由两大机制进行调控:一是细胞周期驱动机制；二是细胞周期监控机制，并且在细胞周期的许多时相点上存在细胞周期检测点，使DNA复制和有丝分裂准确无误地执行。目前认为射线杀灭肿瘤是通过对细胞内核心物质DNA损伤作用来完成的。而细胞一旦发生DNA损伤，DNA损伤首先启动损伤感应机制，将DNA损伤转化成信号，由信号传导通路传至细胞周期检测点，产生细胞周期阻滞，保证细胞有足够时间对损伤的DNA进行修复。若DNA损伤得到完全修复，细胞周期可进入下一个时相，细胞周期仍可正常完成；若DNA损伤修复失败，使Bax和Bcl凋亡通路紊乱，促使损伤细胞进入凋亡，从而避免DNA损伤带到子代细胞，维持了组织细胞基因组的稳定性。因此，细胞周期阻滞是细胞抵抗DNA损伤的保护机制，是维持细胞正常分裂而不被杀死的重要手段。在细胞周期的许多时相点上存在细胞周期检测点（cell cycle checkpoint）。细胞受损后，尤其增殖分裂细胞（如肿瘤）可以产生明显的细胞周期再分布，主要表现为在不同周期检测点上形成不同的周期阻滞，其中功能最重要、研究最透彻的是G1/S和G2/M期检测点。

G1期阻滞的传导途径为DNA受损信号通过多种途径传递给p53基因，导致P53蛋白的升高，Ser15和Ser37和N末端残基磷酸化，并进一步启动p21基因转录，使P21蛋白升高，从而抑制CDK4/6－cyclin D和CDK2－cyclin E等作用底物，使Rb蛋白磷酸化受阻，无法释放E2F，使细胞阻滞于G1期，阻止损伤的DNA进入S期进行复制，从而避免了新合成的DNA将损伤固定下来而传入下一代。G1期的阻滞要求细胞具有野生型P53。p53基因在人类细胞周期G1期检测点中的地位极其重要，若p53基因突变，则细胞在DNA受损时不能产生G1期阻滞。

G2期阻滞的传导途径一般有两条，其中最重要的一条是DNA受损信号传至ATM（共济失调毛细血管扩张症突变基因蛋白）和ATR（ATM相关蛋白）蛋白。ATM和ATR激酶同属于磷脂酰肌醇蛋白激酶（PIKK家族成员）。ATM和ATR具有同源序列和相同的作用底物，但它们感应的基因毒性不同。ATM感应的一般是电离辐射产生DNA双链断裂，而ATR感应的则主要是DNA复制叉增殖的停滞以及DNA单链断裂。ATM的激活需要Ser1981自磷酸化，此种磷酸化对ATM的激活是必须的，从而使得ATM二聚合体解离。但是这种激发机制目前还不太明确。ATR也能够自身磷酸化，但还不清楚ATR自身磷酸化在细胞内是形成无活性的二聚物还是有活性的单体。ATR激活通路主要依赖于DNA单链损伤通过replication protein A（RPA）与ATR的结合位置，由ATRIP（ATRinteracting protein）调节亚基来完成。ATM/ATR产生的周期阻滞主要是ATM/ATR激活下游的Chk1/Chk2，ATM主要作用于Chk2Thr－68磷酸化，ATR主要作用于Chk1Ser－345和Ser－317的磷酸化，Chk1/Chk2作用于CDC25蛋白使其Ser216磷酸化，这种磷酸化使得CDC25C磷酸酯酶的活性减低，并且与活化的CDC25被14－3－3σ蛋白结合并锚定于细胞膜，阻止CDC25磷酸酯酶进入细胞核，从而无法使细胞核内由Weel等磷酸化的CDC2Tyr－15和Thr－14去磷酸化，细胞阻滞于G2期无法进入分裂期；另一条则是受损信号作用于ATR/ATM和DNA－PK，然后作用于P53，通过P21、14－3－3σ和GADD45等作用底物来抑制细胞MPF复合物的活性，这样细胞也可以阻滞于G2期，阻止细胞在DNA损伤得到修复前进行分裂，避免错误的遗传信息进入子代细胞。

三、p53在G2期阻滞中的作用

p53基因是一重要的抑癌基因。在一般情况下，p53突变的细胞不发生G1期阻滞，而主要表现为G2期阻滞。G2期阻滞主要是依赖ATM和ATR等调节。大量的文献报道，咖啡因可以通过抑制ATM和ATR去除G2期阻滞，但要求这种细胞p53基因突变或功能缺失。由此可见p53基因的存在对细胞DNA损伤后G2期阻滞的产生和稳定具有一定的作用，但是这种作用在G2期阻滞的形成中比较弱。p53基因的这种作用主要是由p53通过p21、GADD45和14－3－3δ等基因的转导作用对阻滞于G2期的细胞进行调控，如:GADD45主要是通过破坏Cyclin B1和CDK1的结合能力，而使其复合物活性减弱或失活。14－3－3δ则是阻止Cyclin B1和CDK1复合物于胞质内，不能进入胞核，破坏细胞进行分裂。而P21则可结合CDK1，但其结合能力相对较弱，它主要是抑制CDK1的Thr161磷酸化，这在细胞分裂中是必需的，并且p53对G2期阻滞的作用还可以由p21通过CDK抑制Rb蛋白家族中P130和P107的磷酸化，而这种Rb磷酸化蛋白可以激活细胞G2/M转换所必需的大量基因的转录。然而，约有50%以上的人类肿瘤细胞存在p53基因突变或功能缺失，且肿瘤细胞通常还伴有细胞周期检测点蛋白的缺陷，如Mre11、Nbs1、BRCA1、BRCA2等，因此有报道称几乎所有的肿瘤细胞在照射后都发生不同程度的细胞G2期阻滞。尤其对于p53基因突变的肿瘤，辐射引起细胞G2期阻滞成为此种细胞在分裂前对DNA修复的唯一保护机制，G2期的阻滞对于这部分肿瘤细胞的存活至关重要，因此G2期阻滞要比G1期阻滞显得更为重要。

有报道显示放射诱导G1期阻滞的时间长短与放疗后细胞的存活率没有明显的联系，相对而言，也有文献报道辐射所致凋亡与细胞从G2/M期阻滞的快速退出有关，辐射引起细胞G2期阻滞的时间长短与进入分裂的细胞内未修复的DNA的比例有关，并且在破坏放射引起的细胞G2期阻滞的同时，细胞照射后的存活率也明显下降。若人为去除G2期阻滞（利用细胞周期检测点的调节剂，如咖啡因、UCN－01等），强制细胞带有受损的DNA进入下一细胞周期，则加速了细胞凋亡，从而提高了肿瘤细胞的放疗敏感性，因此可以说G2期阻滞的程度和肿瘤细胞的敏感性有关。

四、辐射对肝癌细胞MHCC97H细胞周期的影响及咖啡因的增敏研究

我们曾采用肝细胞癌细胞株MHCC97H进行辐射对细胞周期阻滞的试验观察以及咖啡因对其增敏机制的研究。已有试验证实，MHCC97H为p53突变细胞株。我们对MHCC97H细胞照射不同剂量后继续培养14h后收获，发现未照射组细胞的G2期比例为13.85%，照射8、16、24Gy时G2期比例明显提高，分别为25.59%、41.36%、51.57%，并且我们在细胞受相同剂量照射后，在不同时间点收获观察辐射引起G2期阻滞的时效性，发现细胞照射14Gy后6h后就明显增高（由最初的10.80%升至17.33%），在12h左右达到最大值37.64%，24h开始回落，到72h基本恢复正常。由此可见:辐射可导致G2期阻滞，并且G2期阻滞的程度随着剂量的升高和一定时间范围内的推移而逐渐升高，而辐射并未引起G1期阻滞。这就说明肝细胞癌可能是受到辐射后通过ATM/ATR→ChK1/ChK2→CDC25→MPF的信号传导途径使肝癌细胞产生G2期阻滞。

并且，我们在细胞照射后加入2.5mmol/L咖啡因，观察到咖啡因能够去除G2期阻滞，并和时间相关，6h后G2期细胞比例较单纯照射组开始降低，在12h左右G2期细胞比例与单纯照射组差距最大（由37.64%降为29.64%），并且咖啡因＋照射组的G1期细胞比例在72h左右较单纯照射组明显增加，同时凋亡的比率也逐渐增加。这就说明了照射后咖啡因能够去除由于照射产生的G2期阻滞，使G2期阻滞的时间缩短，也使损伤的DNA在染色体分裂前不能得到完全修复，这种细胞带有受损的DNA能够进入下一个细胞周期，从而启动了凋亡程序，促进了凋亡，增加细胞的放疗敏感性。

MPF复合物是细胞由G2期进入M期的关键性物质。我们观察了咖啡因放射增敏分子生物学机制与MPF的关系。首先，研究照射与咖啡因对Cyclin B1的影响，分未照射组、照射组和咖啡因＋照射组三组进行细胞爬片实验。加入咖啡因后对细胞进行照射16Gy后继续培养12h，然后免疫细胞化学和免疫荧光定性和定量检查。结果显示:未照射组的细胞阳性率为细胞照射后（56.32±6.41）%；照射组的细胞阳性率为（25.48±1.49）%，相对于未照射组明显减少（t检验，P＞0.05）；而照射＋咖啡因组的细胞阳性率为（34.62＋5.38）%，较照射组的细胞阳性率增加（t检验，P＞0.05）。由此可见放疗可以使Cyclin B1的表达减少，这有可能使MPF的活性减弱，从而产生G2期阻滞，这种Cyclin B1的减少可能是由于辐射导致DNA损伤，使得Cyclin B1的mRNA转录减少所致。而加入咖啡因后可以提高Cyclin B1的表达，使MPF的活性增加，增加了阻滞于G2期的细胞进入M期，产生分裂死亡，这与部分的报道相一致。Datta R等报道细胞接受10Gy照射后Cyclin B1mRNA水平下降，这可能是辐射后与C－jun基因有关；Muschel等发现Cyclin B1mRNA水平的下降是剂量依赖性的；Theron T等报道利用细胞核蛋白提纯实验发现，在G2期阻滞时，Cyclin B蛋白可能从胞核移入胞质内；Bernhard EJ和Theron T等报道放射时加入咖啡因，能够增加由于辐射降低的Cyclin B mRNA及蛋白表达，使其恢复至正常水平并且可以使胞质内的蛋白移入胞核，起到一定的增敏作用。但是也有相反的报道指出:非同步化的细胞受到辐射后细胞内的Cyclin B蛋白并没有明显的降低。Narayanan PK等报道辐射可以引起HeLa细胞G2期阻滞的同时常伴有Cyclin B蛋白的增加，而加入咖啡因可以降低Cyclin B蛋白的表达，而达到放疗增敏。在本实验中我们进行统计学比较时，发现Cyclin B1蛋白量影响没有明显的统计学意义。这值得我们进一步的研究。Cyclin B1在MPF只是起到调节亚基的作用，而咖啡因可以提高Cyclin B1的表达，这种升高的Cyclin B1mRNA及蛋白与放疗增敏的关系究竟如何，与凋亡增加的关系是否密切，有待证实。

同时，我们研究了放疗以及加入咖啡因对CDC2Tyr15磷酸化蛋白表达的影响，取生长期细胞加入2.5mmol/L咖啡因4h后照射16Gy，在不同时间点收获细胞，进行蛋白印迹检验，观察磷酸化CDC2Tyr15蛋白表达。结果显示:单纯照射组的磷酸化CDC2Tyr15蛋白在6h后已经明显增加，且在12h基本上达到最大值，24h后开始下降，这与辐射导致细胞G2周期阻滞在时间上相互一致。由此可见辐射导致细胞G2期阻滞与CDC2蛋白水平的增加有关；而在加入咖啡因后，在12h后，磷酸化CDC2Tyr15蛋白表达较对照组明显减少（P＜0.05），且随着时间的推移表达量逐渐变弱，由此可见咖啡因降低磷酸化CDC2 Tyr15蛋白的表达，这与咖啡因去除G2期阻滞和凋亡比例的增加在时间上基本相互吻合，由此说明咖啡因通过增加CDC2Tyr15脱磷酸化而达到放疗增敏促进凋亡的效果。本实验细胞克隆集落实验也正好说明了咖啡因的放疗增敏效果，放疗增敏比SER＝1.2。这与很多报道一致，Winters Z等报道咖啡因可以增加CDC2的去磷酸化；Theron T等报道，咖啡因类药物能够通过抑制放射诱导的CDC2蛋白水平的增加，去除G2期阻滞；Yao SL等的研究证明，咖啡因类药物能够激活CDC2激酶，使细胞通过G2期进入M期；Zhou BB等认为咖啡因可以抑制ATR激酶和ATM激酶，从而通过降低CDC25C的磷酸化程度，来进一步使CDC2的去磷酸化，最终阻止进入G2/M期的肿瘤细胞进行DNA致死性修复，促进了凋亡；Mailand N等报道咖啡因可以调节CDC25的活性来进一步影响CDC2达到放疗增敏。

咖啡因通过去除p53突变的肿瘤细胞由辐射引起的G2期阻滞，破坏肿瘤细胞的自我保护作用，这可能是该药放射增敏的重要机制。

总之，参阅众多国内外的文献，可以公认的是咖啡因的增敏效果主要是通过增加CDC2去磷酸化，从而去除辐射引起的G2期阻滞，减少细胞在G2期DNA损伤的修复，促进凋亡，增加放射敏感性，并且对p53突变细胞株放疗增敏效果更佳，因为这种细胞已经失去了G1期监测点，但人正常细胞没有p53突变，因此，肿瘤放疗时应用咖啡因，可以在不增加周围正常组织损伤的情况下有选择性地对肿瘤细胞进行放疗增敏。Jha MN等还报道，咖啡因可以去除辐射导致肿瘤细胞株，如HeLa、MCF7、OVGI的G2期阻滞，增加肿瘤细胞的放疗增敏性，而对于人正常细胞株（如人成纤维GM2149、GM4626、AG1522细胞株），咖啡因并不增强辐射的敏感性。Deplanque G等也报道，对于处在G0期的细胞（人正常的纤维母细胞），咖啡因不增强射线的作用。这对于肝细胞癌的放疗显得尤为重要，因为正常肝细胞处于G0期，因此，肝癌增敏放疗可以不增加周围正常肝脏组织的增敏额外负担。

五、意义与应用

肿瘤细胞受到辐射后产生周期再分布，是肿瘤放疗的增敏理论基础。国内外众多的体内外实验证实，肿瘤细胞受到辐射后产生周期再分布，而辐射对正常的细胞并没有产生周期的再分布，两者之间的差别优势一目了然。大量的实验研究表明，在不增加正常组织额外负担的情况下，利用有效的药物干扰受照射肿瘤细胞的周期阻滞从而达到增加细胞放射增敏性的效果。国内外文献报道，很多种药物能够调节受照射细胞周期的检测点，如咖啡因、己酮可可碱（PTX）和UCN－01等比较具有代表性的能去除辐射引起细胞G2期的阻滞。再如临床报道利用化疗药物紫杉醇、吉西他滨等也能够提高肿瘤的放疗效果。

在分割照射中，肿瘤作为一个整体，其内部存在不同时相的细胞并且细胞的增殖速度较快，受辐射后产生的细胞周期再分布可以产生自我增敏的作用（self－sensitization），但是这种自我增敏并不发生于非增殖细胞群中。因此，分割照射能够提高肿瘤放疗的杀灭效应，主要是因为射线作用于肿瘤内存活的具有增殖分裂能力的细胞而非作用于正常组织。对于辐射后由于细胞周期再分布而产生什么不同的生物学差异，以及肿瘤杀灭效应和细胞照射后再分布是否有特定的内在联系，尤其是否可通过干预细胞时相再分布而改变细胞放射敏感性有待于进一步研究。

（曾昭冲　张树民）