临床放射肿瘤学的分子生物学标记物

第五节　临床放射肿瘤学的分子生物学标记物

放疗是恶性肿瘤综合治疗中的一个重要手段。应用放疗作为一种肿瘤根治的手段，或者与手术、化疗联合应用，在大多数的肿瘤患者中可以取得很高的肿瘤局部控制率。然而，尽管放疗应用了近似正常组织可耐受的剂量，仍然存在许多患者局部肿瘤未控，或者出现放射野内的肿瘤复发。另外，放疗后正常组织的放射性损伤也成为限制肿瘤放射剂量、影响肿瘤治疗效果的重要因素。因此，寻找新的、有效的预测肿瘤患者放疗失败及放射性损伤发生的手段非常重要，在这一领域的研究中，分子生物学标记物正成为研究热点。分子生物学标记物是近年来随着免疫学和分子生物学技术的发展而提出的一类与细胞生长及增殖有关的标记物。大量的研究结果表明，许多分子生物学标记物的表达均与肿瘤细胞内在的放射敏感性相关。分子生物学标记物是否可以作为预测肿瘤放射敏感性的指标仍有待于进一步研究。

一、预测肿瘤放射敏感性的分子标记物

虽然传统的临床——病理学因素，包括患者的年龄、性别、种族、肿瘤的TNM分期、病理组织学亚型、肿瘤分级及分化等一直作为一个广泛应用的预测肿瘤全身转移及局部复发的因素，而且这些传统因素在识别肿瘤全身转移及局部复发的危险因素，并制订局部及全身临床治疗方案方面是很有帮助的，但是我们仍然需要其他更灵敏的预测标记物，以帮助我们改进治疗策略并提高治疗效果。目前已有大量的关于以分子标记物作为肿瘤预后的预测因素及作为肿瘤靶向治疗靶点的研究。尤其值得注意的是，日益增多的研究集中在与预测肿瘤的放射敏感性及肿瘤放疗局部控制有关的分子标记物方面。

利用有关的分子标记物，预测肿瘤放射敏感性及放疗后肿瘤局部控制情况具有多方面的意义。首先，这些标记物可以用来帮助医生识别哪些患者标准放疗后，仍具有肿瘤局部控制失败的潜在风险，从而需要修正他们的治疗方案。例如，如果表达一种特异的分子标记物预示着患者经过标准的放疗后有局部肿瘤未控的危险性，那么这些患者就可以从一种改良的治疗方法中获益，比如改用加速分割、同时合并化疗或手术治疗等。另外，分子标记物除了可作为预测预后的因素、用来指导临床决策的制订外，还提供了分子靶向治疗的可能性。如果过度表达某一特定的分子标记物与肿瘤的放射抵抗性有关，那么用特异性的抗体来靶向性对抗这种标记物，或者采用其他治疗手段来下调或者上调这种标记物的表达，就有可能会增加肿瘤的放射敏感性并最终提高肿瘤放疗后的局部控制率及治愈率。然而，应用以分子标记物作为治疗靶点来逆转放射抵抗性的方法，其有效性尚有待于进一步探讨，因为表达一种特异的分子标记物可能很明确的与放射抵抗性有关，但是这可能并不意味着直接与放射敏感性有关。最明显的例子是肿瘤的乏氧因素可能上调多种癌蛋白的表达，在这种情况下，放射抵抗性可能与乏氧因素直接有关，而过度表达的分子标记物可能只是乏氧的一个信号。因而，此时如果不根本解决乏氧问题，而只是靶向性针对分子标记物本身，可能并不会提高放疗的效果。另一方面，对于任何生物模型而言，正确评价以分子标记物为靶点的靶向治疗的可行性及有效性都是非常复杂的，常常会出现不相一致甚至是完全相反的结论:一种特异的分子标记物不能明确预测某种肿瘤放疗失败的可能性，但对其中的一部分患者却可能是一种有效的预测因子；某一个分子标记物可能只是一个弱的预后预测因子，然而几个分子标记物的共同表达对放疗预后的预测却可能会有非常重要的意义。

近年来分子生物学技术的飞速发展，使我们对肿瘤的分子生物学行为及治疗后的分子生物学反应有了更深刻的认识。本部分将阐述与腹盆部肿瘤的细胞凋亡、血管发生、细胞周期、DNA修复、肿瘤生长及乏氧等方面有关的肿瘤标记物，并陈述这些分子标记物在评估肿瘤放射敏感性及放疗后肿瘤局部控制率方面的重要意义。

（一）表皮生长因子受体

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种跨膜蛋白，也是一种酪氨酸激酶受体，与ERBB2——即我们通常所说的HER－2/neu同属于ERBB家族。EGFR在所有表皮性来源的正常组织细胞中均有表达，并在这些细胞的生长、增殖和分化中起着重要作用。在表皮来源的恶性肿瘤组织，如消化道肿瘤、子宫颈癌及其他腹部肿瘤中也广泛表达。临床研究显示，在胰腺癌，结、直肠癌，膀胱癌等恶性肿瘤中，EGFR的表达是一种预后的不良因素，表现为总生存率及无病生存率低；也有一些研究显示，EGFR的表达与放疗患者的局部肿瘤控制失败有关。由于EGFR的信号传导通路可以激活细胞周期的传导途径从而促进细胞的增殖，因此，EGFR抑制因子常常可以起到抑制细胞增殖的作用，主要表现在细胞周期的G1期阻滞，从而阻止细胞进入S期的转化。通常，放疗导致细胞周期G2期阻滞，因此推测，EGFR抗体合并放疗，能一定程度上抑制EGFR引起的细胞周期的G1期停滞，并阻止放疗导致的细胞周期G2期停滞。另外，EGFR抑制剂还可以促进放射所致的细胞凋亡，并且抑制细胞放射损伤的修复。迄今为止，很多离体及在体实验研究显示，应用EGFR的单克隆抗体（C225）可以明显提高放射线对肿瘤细胞的杀伤作用，特别是在结肠癌及卵巢癌的在体实验模型上，C225有很显著的放射增敏作用。最近Saltz等报道了C225对EGFR表达水平不同的结、直肠癌的治疗，其效果相似，因而临床应用范围更广泛。比较单纯的放疗与放疗合并应用EGFR抗体西妥昔单抗（IMCC225，Cetuximab）治疗胰腺癌、大肠癌等的Ⅱ、Ⅲ期临床试验正在进行，实验的最终结果令人鼓舞。另外，一些研究还应用了EGFR酪氨酸激酶的特异性抑制剂，通过抑制EGFR的酪氨酸激酶，抑制EGFR的生物活性，进而达到抑制肿瘤细胞的作用。一系列临床前期研究显示，EGFR酪氨酸激酶的特异性抑制剂具有与C225相似的作用，例如抑制肿瘤细胞的增殖，增强放疗效果等。结肠癌在体实验方面，Williams等报道ZD1839可将放疗疗效增加60%。总之，目前的研究说明了EGFR的表达与肿瘤的放射敏感性及肿瘤的局部控制率有关，并且从理论上说，可直接对抗EGFR的作用，从而影响细胞增殖的信号传导途径，改变肿瘤对辐射的敏感性，目前的实验室及临床研究也证明了这一点。EGFR作为分子标记物，可以预测肿瘤的放射敏感性并且可以作为肿瘤靶向干预治疗的直接靶点。

（二）HER－2/neu

酪氨酸激酶家族的另一个成员ERBB－2或HER－2/neu，在多种肿瘤中广泛表达。研究明确证实，肿瘤过度表达HER－2/neu的乳腺癌患者，经过有特效的化疗药物化疗后，生存率及有效率均较低。在HER－2/neu基因过度表达的其他肿瘤中，如前列腺癌、胃癌、结肠癌等情况亦大体如此，HER－2/neu基因的高表达也与肿瘤的不良预后及耐药性相关。HER－2/neu抗体的发展对肿瘤的临床治疗带来了重要影响，过度表达HER－2/neu的转移性肿瘤患者，单纯的HER－2/neu抗体治疗或HER－2/neu抗体合并细胞毒药物的治疗，可明显获益。虽然目前关于HER－2/neu及放射敏感性的研究并不很多，但是无论实验室研究还是临床研究资料均显示，过度表达HER－2/neu基因的患者放疗效果较差。实验室研究证明，过度表达HER－2/neu基因可能与过度表达EGFR相同，与相对的放射抵抗性有关。Pietras等在体外细胞实验中发现，过度表达HER－2/neu基因的细胞放射抵抗性较强。此外，他们还证明了合并应用HER－2/neu的抗体，放射敏感性增加。另一些学者的研究也得出了相同的结论:Rao等研究证明了一种新的小分子的ERBB酪氨酸激酶抑制剂CI－1033具有辐射致敏作用。

Stackhouse等证明了转染抗ERBB2单链抗体的细胞放射敏感性增高，并且，他们还指出针对HER－2/neu受体的靶向治疗可能会提高放射敏感性。一些临床研究支持了实验室的研究结果，显示出HER－2/neu基因的过度表达可能与相对的放射抵抗性相关联。Haffty等在一项保乳治疗的乳腺癌病例对照研究中观察到，局部复发的患者其肿瘤过度表达HER－2/neu的可能性更大。Elkhuizen等研究对保乳治疗的患者虽然未达到统计学差异，但结论却与Haffty等的研究相类似。最近，Pentopoulos等对一组术后放疗胸壁的乳腺癌患者观察，发现过度表达HER－2/neu基因的患者，胸壁肿瘤的复发率和进展率高。Formenti等也注意到，在一组应用化疗及放疗的局部进展期的乳腺癌患者中，HER－2/neu基因低表达的患者往往治疗效果较好。然而，也有少数研究显示HER－2/neu基因的表达与放疗效果及肿瘤的局部复发之间没有相关性。在HER－2/neu的检测方面，既往的许多研究中均应用了免疫组织化学法，这可能是造成不同结果差异的原因之一。在未来的研究中，应用更敏感、更精确、更有临床价值的荧光原位杂交技术（FISH）对HER－2/neu进行检测，这在预测放射敏感性方面将起到更重要的作用。

（三）p53

抑癌基因p53在细胞周期的转变、DNA修复及细胞的凋亡中起到了关键性的作用。通常，野生型p53在激活细胞的凋亡程序中起作用，因此，p53在评价放疗及化疗对肿瘤的治疗效果方面起到了关键作用。野生型p53的生长阻滞作用依赖于对p21的转录激活，p21最终抑制细胞周期调节蛋白复合物，并且阻止G1期细胞向S期的转变。通过激活促凋亡基因BAX，及下调抗凋亡基因BCL－2，p53在细胞的凋亡中扮演了重要角色。因此，细胞对放射线的反应可能依赖于p53基因的正常功能。然而，p53的作用是复杂的，因而，对于放疗效果的影响也是双向的。多数学者认为p53的这种双向作用可能是由于在p53功能缺陷时，细胞凋亡的减少被DNA修复缺陷所抵消的结果。肿瘤细胞p53基因发生突变时，通常导致P53蛋白的过表达及积聚。然而，p53基因的突变与蛋白的表达水平常常并不相一致，换言之，蛋白的表达常常并不与基因突变相关，p53基因的突变也可能并不常常引起蛋白的过度表达。这一因素，加之p53在细胞周期的调节、细胞的凋亡及DNA修复中的复杂作用，导致了p53基因与放疗效果之间令人费解的不同的作用结果。一些研究结果显示，p53的表达与放射敏感性的增高、降低或无变化均有关。由于上述的p53基因作用的复杂性及不同临床数据集之间或同一数据集内部存在的异质性，迄今为止，各项研究的结果仍不相一致。然而，尽管如此，多数的临床研究还是肯定了p53在预测肿瘤局部控制及放疗效果方面的重要性，并提出p53可能是一个预测放疗效果的重要因素，指出p53基因突变与较差的肿瘤局部控制率及无病生存率有关。Koch等的研究证明了p53突变的患者局部肿瘤控制较差，与野生型p53组相比，相对危险度为2.4。另外，还有研究表明，p53基因的突变与肿瘤的局部复发及放疗效果有关，而P53蛋白的表达却并非必需。Turner等在对乳腺癌患者的病例对照研究中观察到，肿瘤局部复发的人群具有较高的p53基因过表达率。然而，Elkhuizen等在对接受保乳治疗的乳腺癌患者的研究中，却未能证明p53的表达与肿瘤的局部控制率有关。Silvestrini等的研究也未能显示出接受保乳手术及放疗后，肿瘤的局部复发与p53基因存在相关性。然而，值得注意的是，有些研究确实证明了保乳手术治疗未经放疗的患者，过度表达P53时有较高的肿瘤局部复发率。Zellars等在一项大宗临床试验中观察到，在接受乳房切除术的患者中，过度表达p53的患者，无论术后是否接受放疗，都有更高的肿瘤局部复发率。另外，还有大量的包括宫颈癌、前列腺癌、大肠癌等关于腹盆部肿瘤的研究，对于应用p53作为预测因子，来衡量放射敏感性及标准方案的放疗后肿瘤的局部控制率，也都得到了肯定或否定的结论。例如，表达野生型P53蛋白的人卵巢癌细胞系对放射线高度敏感，而含有异常P53蛋白者对放射线则表现出不同程度的抵抗；78%的放射抗拒性结肠癌P53蛋白染色阳性，异常P53蛋白的表达还可能与结肠癌的放射抵抗性相关；直肠癌术前放疗研究结果也表明，多数P53阴性病例对放射线敏感，而多数P53阳性病例对放射线抵抗，放疗后手术可见到前者肿瘤体积比后者明显缩小，而且P53阳性组肿瘤局部复发率及远处转移率均高，5年生存率低。有学者认为，异常P53蛋白不能像野生型P53蛋白那样产生介导辐射后引起的细胞凋亡，这可能是异常P53蛋白表达与放射敏感性呈负相关的原因。另有学者建立了3个膀胱移行细胞癌细胞系照射后的细胞存活曲线，定量分析表明，P53蛋白阳性率最高的细胞系对放射线的敏感性最高，认为异常P53蛋白表达与放射敏感性呈正相关。基于不同的研究之间技术的差异性，患者的不均一性，相对少的病例数，蛋白表达及p53基因状况的不一致性，连同P53在细胞周期调节、DNA修复及细胞凋亡中所起到的复杂作用等因素，不相一致的研究结果并非出乎意料。显然，在确定P53表达对于预测放疗敏感性的临床功效方面的意义，尚需要进一步检测P53的蛋白、基因水平以及与其他标记物的共表达状况。由于P53在细胞应答中确实起到重要的作用，并且可能用来作为靶向治疗的目标，因此，阐明它作为预后预测因子及靶向治疗靶点来提高放疗敏感性的作用值得进一步研究。

（四）BCL－2/BAX

BCL－2是一种癌基因，其蛋白产物通过抑制细胞凋亡从而起到促进肿瘤细胞存活的作用。研究显示，BCL－2蛋白的相关同系物BAX与BCL－2形成异源二聚体，进而对抗BAX促进细胞凋亡的作用，因此有学者认为BCL－2与Bax的比例可能是决定细胞凋亡刺激信号的敏感性的重要因素之一。BCL－2在许多实体肿瘤，如乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌及结肠癌等细胞中呈异常高表达，使肿瘤细胞存活时间延长。理论上说，过度表达抑制凋亡的基因或下调促进凋亡的基因都可以导致放射抵抗性的表型。因此，同时BCL－2过度表达及BAX低表达与减少放疗的凋亡反应及增加放射抵抗性有关。与之相反，BAX升高及BCL－2降低将伴随细胞凋亡的增加及放射敏感性的提高。一些研究已经证实了这些相互关联的原癌基因影响临床放疗效果的功能。Palazzo等在对放射抵抗性结肠癌术前放疗的研究中发现，48%的病例存在BCL－2蛋白的异常表达，Mackey等在对41例接受外照射的前列腺癌患者的研究中证明，BCL－2/BAX比值高的患者放疗失败的危险性增加。Pollack等在对接受术前放疗的患者的研究中也发现，过表达BCL－2的患者治疗效果较差。Harima等还报道了在接受根治性放疗的子宫颈癌患者中，放疗前的BCL－2及BAX水平与放疗效果无关，但照射10.8Gy后，BAX表达增加的患者放疗效果好，而BCL－2表达增加的患者放疗效果差。设想可能是由于抗凋亡蛋白BCL－2的过表达，允许肿瘤细胞在广泛的放射引起损伤的情况下继续增殖，因而临床上便显示出了放射抵抗性。然而，Concin等关于人卵巢癌细胞系的研究却表明，BCL－2的表达与放射敏感性无关。虽然目前的研究结果尚存在不一致性，然而，已有充足的证据支持利用BCL－2/BAX家族蛋白作为预测放射敏感性标记物的意义。目前，在大量的同系患者中，制订临床决策前，应用标准化技术，对BCL－2/BAX等其他标记物一起共同检测已成为常规。

（五）RAS/RAF－1

ras基因家族包括H－ras、K－ras和N－ras。ras基因编码的小GTP结合蛋白－RAS是调节细胞生长的重要蛋白质。肿瘤细胞的ras基因突变率大约为25%，有些肿瘤细胞可高达80%以上，而在胰腺癌中，K－ras基因的突变约达90%以上。ras基因突变可导致RAS蛋白与三磷酸鸟苷（GTP）的持续结合并促进细胞生长。在鼠胚胎成纤维细胞和人的肿瘤细胞株中，ras过表达的细胞较之对照组细胞具有更强的辐射抵抗性，说明其抗辐射作用与RAS活性相关。ras基因突变的肿瘤细胞，一旦RAS活性被抑制，即表现出辐射敏感性。Gupta等发现，H－ras基因突变的人膀胱癌T24细胞比野生型H－ras膀胱癌RT4细胞的辐射敏感性低、存活率高。以法尼基转移酶抑制剂（FTI）L744832阻断RAS的翻译后加工过程，抑制RAS的活性，则T24细胞的存活率下降。在K－ras基因突变的胰腺癌细胞中也得到类似实验结果，转染反义ras片段抑制RAS活性，细胞的辐射敏感性增高。研究表明，RAF－1的高表达和异常激活可能与肿瘤的发生有关，RAF－1介导了异常的细胞增殖、分化和生存活动，参与了细胞周期的控制和调节细胞的凋亡活动。RAF－1必须与RAS蛋白的调控区域结合后，在其他一些分子的共同作用下才能被激活。一些研究还表明，RAF－1介导的RAS－RAF－ERK通路的激活与肿瘤内部的血管生成、肿瘤的增殖和凋亡密切相关。肿瘤细胞受照后能使RAF－1基因活化，激活RAS/RAF/MAPK途径，导致放射敏感性的改变。Pfeifer等将外源性RAF－1与癌基因Myc共转染永生化的人支气管上皮细胞，导致该细胞株发生恶变并引起辐射抗性显著提高。Kasid等将组成性激活RAF－1（constitutively active RAF－1）转染人鳞状上皮癌细胞，发现明显提高了该细胞株在半数致死剂量辐照后的存活率，减少了细胞的凋亡，提示RAF－1介导的信号通路与肿瘤辐射抵抗性的产生关系密切。这些研究都表明，RAF－1及其介导的信号通路可能成为非常有潜力的肿瘤放疗的增敏靶点。很多研究表明，利用各种技术对RAF－1进行阻断，都取得了较好的辐射增敏效果。Gokhale等将人前列腺癌细胞在裸鼠体内致瘤后，应用RAF－1反义寡核苷酸片段（LErafAON）静脉注射入裸鼠体内，同时进行肿瘤局部放射，发现试验组的肿瘤细胞发生明显的退化和凋亡。目前LErafAON已作为放疗增敏剂进入第一阶段的临床实验。另外，RAF－1激酶抑制蛋白（RKIP）、RAF－1抑制剂BAY43－9006和反义寡核苷酸ISIS5132等在放射增敏方面也有很好的应用潜力。其他一些研究表明，干涉或抑制与RAF－1成熟和激活密切相关的一些信号蛋白分子，如热激蛋白90（HSP－90）、RAS蛋白和蛋白激酶C（PKC）等，间接阻断RAF－1，同样可以取得很好的辐射增敏效果。总之，RAS/RAF－1可作为多种肿瘤辐射抵抗性的分子标记物，对抗RAS/RAF－1的作用可以提高放射敏感性，针对RAS/RAF－1的高效的检测手段及有效的对抗手段的开发，有望为肿瘤的放疗开拓新的思路。

（六）胰岛素样生长因子1

胰岛素样生长因子1（Insulin－like growth factor－1，IGF－1）是调节人体生长和发育的重要的内分泌激素，可以起到介导生长激素、发挥调节生长功能的作用。IGF－1在细胞的有丝分裂周期中，是细胞从G1期向S期转变所必需的因子，IGF－1还通过自分泌和旁分泌的方式对骨、肌肉、皮肤、神经等组织细胞的增殖、分化起重要的调节作用。已经有较多的研究发现，循环中IGF－1的浓度增高与结肠癌、乳腺癌和膀胱癌等肿瘤的发生与发展有关。Chan等研究了152例膀胱癌患者和152名健康对照者血液中的IGF－1水平，发现IGF－1水平与膀胱癌的发生显著相关，并且IGF－1/IGFBP－3对晚期膀胱癌有预测作用，具有高水平IGF－1和低水平IGFBP－3的男性患晚期膀胱癌的危险度是低水平IGF－1组的915倍。在分析结肠癌与IGF－1的关系的研究中也发现，随着IGF－1的增加，患结肠癌的危险性也增加。其他肿瘤，如绝经期妇女其循环中IGF－1水平高而IGFBP－3水平低，则患乳腺癌的危险性增加。在同等程度肝硬化和肝功能衰竭的情况下，肝脏肿瘤的发生与IGF－1/IGFBP－3的高比值有较大的相关性。胰岛素样生长因子受体1（IGF－1R）是IGF－1的受体，与介导细胞的生长、黏附及抗凋亡有关。许多研究表明，过度表达IGF－1R与细胞系的放射抵抗性有关。Tezuka等证明了在鼠的胚胎成纤维细胞系中，过度表达IGF－1R的克隆原细胞具有放射抵抗性，并且对于γ线照射后诱导的细胞凋亡有抵抗作用。Peretz等的研究显示了共济失调毛细血管扩张症突变体（ataxia telangiectasia mutated，ATM）实现调节DNA修复、控制细胞周期及影响细胞凋亡的功能与IGF－1R的表达之间存在着密切的联系，IGF－1R表达的减少促成了AT细胞辐射敏感性的增加。他们还证明，应用反义IGF－1R或应用中和IGF－1R胞外域的抗体都可以干扰IGF－1R的作用通路，从而增加细胞的放射敏感性。Macaulay等的研究也支持了IGF－IR信号系统可以调节ATM功能的观点，而且，他们还证明了下调IGF－1R可以增加小鼠恶性黑色素瘤细胞的放射敏感性。Turner等的研究结果显示了高水平表达IGF－1R的成纤维细胞系具有较高的放射抵抗性，而且，当细胞与针对IGF－1RmRNA的反义寡核苷酸共培养后，放射抵抗性表型被逆转。Wen等还证明了IGF－1R的选择性抑制剂——酪氨酸磷酸化抑制剂AG1024在人乳腺癌细胞系MCF－7中增加了放射敏感性，并使放射引起的细胞凋亡增加。虽然尚缺乏临床转换性研究来评价IGF－1R在预测肿瘤的放射敏感性及作为靶向治疗靶点方面的重要意义，但是，目前的研究已经可以证明，将IGF－1R作为预测放疗敏感性的预测因子，以及以其为靶点，通过靶向治疗来提高放射敏感性的应用前景。

（七）细胞周期调节蛋白D1（Cyclin D1）

Cyclin D1是一种调节激酶，它在细胞周期从G1期到S期的转换中是一个非常重要的周期调节蛋白。Cyclin D1基因在人类多种恶性肿瘤中的过度表达，包括乳腺癌、膀胱癌、宫颈上皮癌和食管癌等，并且Cyclin D1水平的升高与细胞的凋亡有关。另一方面，研究还证明，Cyclin D1与p21及p27结合后，诱导它们的表达，并且可能起到降低放射敏感性的作用。Cyclin D1作用的复杂性可能导致了在临床及实验室研究中，Cyclin D1对放射敏感性显示出了不同的影响结果。Shintani等对9个鳞状细胞癌细胞系进行的研究中观察到，Cyclin D1水平的提高与放射敏感性的增加有关。在临床研究方面，他们还证明了应用术前放疗的鳞状细胞癌患者的Cyclin D1水平与放射敏感性有关。Coco Martin等的研究也显示出过表达Cyclin D1的MCF－7细胞与无表达Cyclin D1的细胞相比，放射敏感性更高。然而，另一方面，Milas等的研究却得出了相反的结论。在对9种小鼠肿瘤细胞系的研究中，他们证明了Cyclin D1的表达与肿瘤的放射敏感性较差有关。他们还证明了Cyclin D1及EGFR表达之间的强相关性。上述关于Cyclin D1水平与放射敏感性及肿瘤局部控制率之间关系的不相一致的实验室研究结果与临床研究结果相似。Turner等对乳腺癌的研究结果显示出，Cyclin D1的表达与肿瘤局部控制率升高有关，Coco Martin及Shintanti等的临床及实验室研究也都证明了这一结论。然而，Pignataro研究组、Bova研究组及Michalides研究组的研究却得到了与之相矛盾的结论，这些研究组的研究结果证明，过表达Cyclin D1增加了肿瘤局部复发的危险性。目前认为，产生Cyclin D1与肿瘤放射敏感性及肿瘤局部控制率之间相互关系的不同研究结果，很可能是由于Cyclin D1作用的复杂性、较少的病例数、患者的不均一性及缺乏标准的Cyclin D1实验室检测技术所致。显然，为了明确Cyclin D1与放射敏感性及肿瘤局部控制率之间的关系，需要更进一步的实验室及临床研究。虽然目前Cyclin D1尚未成为预测放射敏感性及肿瘤局部控制率的预后因子，亦缺乏以Cyclin D1为靶点的靶向治疗的研究，但不久的将来，有关它的进一步研究将为我们带来令人鼓舞的结果。

（八）血管生成因子

一些研究显示，与肿瘤新生血管形成有关的分子标记物可能成为预测肿瘤患者无瘤生存率、总生存率及治疗敏感性的因素。最常用的评估血管生成的分子标记物包括微血管密度及血管内皮生长因子（VEGF）。虽然在血管形成中存在许多生长因子，目前认为血管内皮生长因子是介导内皮细胞生长最重要的蛋白。一些实验室及临床研究均证明了VEGF与放射敏感性的关系。Gupta等在一项应用转化后过表达VEGF的细胞系的研究中证明，VEGF提高了血管内皮细胞的存活率，并且VEGF阳性的移植肿瘤对放射引起的细胞毒效应更具有抵抗性。另一些研究证明，应用VEGF抗体治疗后，放射敏感性增加。Gorski等的研究结果显示，阻断VEGF的作用提高了肿瘤放疗的效果。Geng等也提出证据证明了抑制VEGF信号传导可以逆转放射抵抗性。以上研究及许多其他研究均提供了充分的实验室证据证明了过表达VEGF与放射抵抗性有关，通过特异性阻断VEGF的信号传导通路可以逆转放射的抵抗性。令人瞩目的是，目前已有一些临床研究结果支持了VEGF作为放射敏感性的预测因子。Smith等的一项临床研究证明，VEGF阳性的患者肿瘤局部复发的危险性增高，相对危险度为3.08。Linderholm等在仅仅接受放疗的淋巴结阴性的乳腺癌患者中观察到，VEGF的表达与患者的无复发生存率及总生存率有关，虽然他们发现VEGF的表达与肿瘤的局部复发无特异性的关联，但他们仍然认为VEGF的表达可能是放射抵抗表型的原因。以上研究结果均支持了VEGF作为预测放疗的预后因子及靶向治疗的靶点，从而增加肿瘤放疗可治愈性的可能性，对于指导我们进一步的临床研究有着深远的意义。

（九）环氧化酶2

环氧化酶2（cyclooxygenase－2，COX－2）是一种诱导酶，许多因素可以诱导其产生。近期的研究表明，在结、直肠癌，胃癌，胰腺癌，肝癌，前列腺癌，宫颈癌等许多肿瘤的癌组织和细胞系中，均可以检测到COX－2蛋白及分子水平的高表达。COX－2具有促进DNA等遗传物质损伤的修复、抑制细胞凋亡、促进肿瘤浸润及新生血管形成等作用，因此，与致癌作用、肿瘤生长及转移播散有重要的关系。Milas研究组及Haffty研究组的实验研究已证明，COX－2的过表达可能与放射抵抗性有关，这一研究结果使得这个分子标记物格外引人注目。另外，从理论上说，相对无毒性的COX－2的抑制剂及非类固醇类消炎药物的使用，可能会克服过表达COX－2的肿瘤的放射抵抗性，最近的实验研究结果也证明了这一点。Milas研究组、Pyo研究组、Ferrandina研究组及Kishi研究组的研究结果均明确地显示了COX－2的抑制剂可以增强肿瘤的放射敏感性。Pyo等的研究结果证明了选择性的COX－2抑制剂NS－398，增加了过表达COX－2的肿瘤细胞的放射敏感性。此外，关于子宫颈癌的临床实验还证明，过表达COX－2的肿瘤，与其放疗局部控制率降低及照射野内的肿瘤局部复发有关。Gaffney等在一项对子宫颈癌接受根治性放疗患者的研究中，报道了过表达COX－2与总生存率及无瘤生存率较差有关。在另一项相关研究中，Kim等发现过表达COX－2与局部肿瘤控制失败及淋巴结转移的高发生率有关。虽然目前的研究病例数较少，但这些初步的研究结果已经证明了应用COX－2表达作为放疗预后预测因子的可能性。在已知过表达COX－2的肿瘤中，应用通常有效的COX－2抑制剂并合并放疗，有可能获得较大的治疗效益，而且相对花费较少、毒性较小，这一设想具有充分的可行性，是目前的一个研究热点。

（十）P21WAF1/CIP1

WAF1编码的21kDa核蛋白，即P21WAF1/CIP1蛋白，是一种细胞素依赖性激酶的潜在抑制因子，在P53介导的G1期停滞中起到了重要的作用。在人类肿瘤中，WAF1基因可以通过其启动子内的P53结合序列被野生型P53蛋白激活，但却不能被异常的P53蛋白激活。Fu CG等的体外实验研究证明，P21WAF1/CIP1蛋白可以调节细胞的增殖，并通过影响细胞凋亡途径来影响肿瘤的放射敏感性。另外，Sreelekha TT等学者通过对人卵巢癌的研究，还发现了低放射敏感性细胞系中，P21WAF1/CIP1基因存在突变点。体内实验研究也得出了相似的结果。Ribeiro JC等在对食管癌术前放疗的研究中发现，71%的放射敏感性病例P21WAF1/CIP1均有表达。Fu CG等对直肠癌术前放疗的研究结果也显示，多数P21WAF1/CIP1阴性的病例对放射线具有抵抗性，而多数P21WAF1/CIP1阳性病例对放射线敏感，术中见后者比前者的肿瘤体积缩小更明显，而且P21WAF1/CIP1阴性组的肿瘤局部复发率及远处转移率均较高，5年生存率则较低。综上所述，虽然目前尚缺乏以P21WAF1/CIP1为靶点靶向治疗恶性肿瘤的研究依据，但P21WAF1/CIP1对放射敏感性的影响已被众多研究所证实。以P21WAF1/CIP1作为放射敏感性的预测因子及靶向治疗的靶点的研究前景不容忽视。

（十一）DNA错配修复基因

DNA错配修复基因（DNA mismatch repair，MMR）是一组高度保守的看家基因，其主要功能是通过其蛋白产物识别复制后错配修复的碱基并启动错配修复反应，校正碱基对的错配及其他DNA多聚酶的错误，因此MMR对保持基因组的完整性和稳定性起着重要的作用。MMR突变将会出现微卫星的不稳定性或复制错误阳性，使整个基因组不稳定性增加，从而引起包括癌基因和抑癌基因的一系列改变，发生各种肿瘤。近年来的研究显示，MMR的表达与人类多种肿瘤，如结、直肠癌，卵巢癌，乳腺癌等以及越来越多的以MLH1基因失活、促进超甲基化为共同发生机制的散发性肿瘤的发生有关。MMR因子也牵涉到哺乳动物的DNA损伤的修复。基于早期对细菌的研究观察到的MMR对烷化反应的作用，近期很多研究证明了MMR缺陷的哺乳动物细胞可显示出对烷化剂的耐受性。这一结论已经扩充推广到许多其他可以引起DNA损伤的因素，包括一些在临床上用于治疗肿瘤的手段，如顺铂和替莫唑胺等。Fritzell等报道的一组研究资料显示了MMR因子中的MSH2、MLH1及PMS2在放疗引起的细胞毒性中的作用，研究结果证明放射后MMR突变的克隆原细胞的存活率比野生型细胞增加，并显示有统计学意义。这些研究的实验对象为通过靶向断裂MSH2、MLH1及PMS2，从而使基因发生了突变的转基因小鼠无限增殖化的胚胎干细胞细胞系。基于以上研究结果，他们提出了一个模型，在这个模型中，细胞亚群（包括被氧化的基团）的放射性损伤，可能具有与MMR介导的和烷基化基团的细胞毒性相同的途径。然而，另一些应用MMR缺陷的人类癌细胞衍生细胞系或者永生的MSH2缺陷的小鼠细胞系的其他研究，却未能发现在放射敏感性方面存在实质性的差别，这一结果引发了争论。最近，DeWeese等应用敲除了MSH2的小鼠细胞进行了研究，结果证明，低剂量率放射时，野生型及MSH2缺陷型细胞的存活率差别比高剂量率放射时更明显。另外，Zhang等的研究也发现，与野生型相比，放射引起的细胞凋亡在MSH2缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞中减少。目前，MMR复合物影响损伤效应的机制尚不清楚。一种假说认为MMR复合物识别出基础损伤，并且启动了无效修复的周期，导致了染色体的缺损及断裂，并可能最终引起细胞凋亡；另外，也可能是MMR复合物识别了损伤，从而直接启动了信号传导途径，诱发了细胞凋亡。目前，许多证据支持了MMR在介导损伤反应信号转导中的重要作用，包括MLH1对顺铂诱导的c－abl激酶的活性的作用及P73的积聚等方面的必需功能。另外，Duckett等的研究还证明，MSH2/MSH6及MLH1/PMS2复合物在细胞应用烷化剂治疗后，P53在丝氨酸15及丝氨酸392的磷酸化的作用中是必需的。与此结论相符，Davis等在人类结肠癌细胞系的实验中观察到了放射后P53的MLH1依赖性诱导作用。而且D’Atri等的研究还证实了MMR缺失的类淋巴母细胞细胞系，替莫唑胺接触后P53的积聚减少。Wu等在对许多致癌物的反应中也观察到了P53的MMR依赖性诱导作用。然而，Zeng等却发现放疗后，单独的P53或PMS2失活的原始成纤维细胞的凋亡降低，并且两者同时失活导致了细胞凋亡效应的更进一步减少，这一结果提示这些因子在放射效应中的作用是不相重叠的。另外，应用从这些原始细胞早期传代建立起来的细胞系进行研究的结果显示出，无论P53的状况如何，放疗后PMS2缺陷的细胞的克隆原细胞存活率均增加，更进一步显示了MMR介导的细胞毒性作用不依赖于P53。总之，这些研究提示MMR缺失可能会改变细胞的放射敏感性。然而，这一发现与临床放疗效果之间的关联性，尚有待于进一步研究。

（十二）细胞动力学/增殖标记物

增殖标记物（proliferative markers）包括Ki－67、增殖细胞核抗原（PCNA）、P105、胸腺嘧啶脱氧核苷标记物、S期成分及可能的倍增时间等，目前认为增殖标记物是放射效果的预测因子。其中PCNA作为一种DNA聚合酶辅助蛋白，是真核细胞染色体DNA复制所必需的成分。PCNA水平与细胞增殖周期进程有关，可作为DNA合成及细胞增殖的标记物。许多细胞增殖周期调节蛋白通过影响PCNA的功能来调节细胞的增殖周期。研究证明，放射敏感性不同的肿瘤，其PCNA指数明显不同。多数学者认为，PCNA指数与放射敏感性呈正相关，即PCNA指数高的肿瘤放射敏感性高。然而，关于增殖标记物对放疗的放射敏感性及肿瘤局部控制的影响也存在不相一致的报道。Desai等对直肠癌术前放射的研究表明，放射前活检标本PC－NA阳性的病例放射敏感性低，PCNA阴性病例放射敏感性高。这种不同的研究结果可能与许多因素有关，包括患者的不均一性、肿瘤的不均一性、放射引起的增殖指数的变化、检测技术上的差别以及相对小的样本量。目前，虽然已经证明了增殖性标记在部分患者中具有预测放射敏感性的价值，但基于尚存在不相一致的研究结果，人们依靠应用这种分子标记物来制订临床决策的设想还需要进一步的研究来支持。

（十三）乏氧标记物

众所周知，肿瘤的氧合状态在多种实体肿瘤的放疗敏感性方面是一个重要的预后因子，因此，依靠肿瘤的乏氧状况来判断及预测标准方案放疗后肿瘤的局部控制情况非常重要。在此，我们将常见的肿瘤乏氧生物标记物及其作用分述如下。

1.乏氧诱导因子1（hypoxia inducible factor－1，HIF－1）　HIF－1是广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，能调节无氧糖代谢、氧运输、新生血管形成等多个靶基因的转录。研究证明，HIF－1在多种人类及动物肿瘤中大量表达，它的过度表达影响着肿瘤的发生、发展及对放、化疗的敏感性。在肿瘤的生长过程中，随着实体肿瘤的增大，其内部不能得到足够的血供，导致肿瘤局部处于缺血、缺氧状态。目前认为，HIF－1在肿瘤组织中的功能之一就是使肿瘤细胞能在缺氧的环境中存活与生长，肿瘤的缺氧状态和HIF－1的表达水平相关。HIF－1通过调节葡萄糖转运子（glucose transporter，GLUT）和多种糖酵解酶类基因的表达，提高肿瘤组织糖转运和糖酵解能力，维持肿瘤细胞的能量代谢，使肿瘤细胞能够适应缺血、缺氧及缺乏营养的微环境；HIF－1还可以通过促进血管内皮生长因子（VEGF）的转录和增强VEGF mRNA的稳定性，促进肿瘤微血管的生成。另外，HIF－1也通过促进与肿瘤侵袭及转移相关的因子和水解酶类的表达，如转化生长因子、基质金属蛋白酶2、自分泌运动因子等，促进肿瘤的侵袭和转移。Heather等认为，HIF－1的过表达在肿瘤的发生发展中起着重要作用。他们的研究表明，在良性肿瘤中，HIF－1的表达呈正常水平；在原发性恶性肿瘤中，HIF－1的表达水平明显增加；在转移病灶中，HIF－1表达的升高则更显著。由于HIF－1与肿瘤的缺氧状态有密切的联系，近年来有学者通过研究HIF－1在宫颈癌中的表达水平以预测肿瘤的放疗效果。Bachtiary等的研究发现，在67例ⅠB～ⅢB期的宫颈癌患者中，HIF－1的表达率为72.1%，其中23.9%为弱表达，37.3%为中等强度表达，10.4%为高度表达。高度及中度HIF－1表达者，对放疗仅表现出部分反应，而且患者的生存率和肿瘤无进展生存时间更短。Ishikawa等对接受放疗的38例ⅢB期宫颈癌患者的分析结果显示，HIF－1的表达率为45%，HIF－1高表达者肿瘤的局部复发率较高，而且肿瘤复发时间更早。Burri等对78例宫颈癌患者的研究发现，HIF－1的表达率为94%，并且随着HIF－1的表达增强，肿瘤进展生存时间及总生存率明显变短，无瘤生存率降低，并证明HIF－1的高表达是影响总生存率的一个独立因素。同时，还有一些研究证明，抑制HIF－1可以增加肿瘤细胞的放射敏感性。Grumann等在研究中发现，冠状平滑肌细胞的再氧合，可以抑制HIF－1基因的表达，从而增加了放射引起的细胞凋亡及细胞的生长延迟时间。Williams等对裸鼠肝脏肿瘤细胞的研究结果显示，HIF－1不足的细胞具有更高的放射敏感性。还有研究证明，应用氧化还原反应调节剂，如替拉扎明（tirapazamine）、AQ4N及HIF－1抑制剂等均可以增加肿瘤细胞的放射敏感性。虽然目前临床上尚缺乏被认可的高效低毒的乏氧细胞致敏剂，但这一领域的进一步研究有着广泛的应用前景。

2.骨桥蛋白（osteopontin，OPN）　OPN是一种肿瘤相关蛋白，通过增加肿瘤细胞的侵袭力、诱导肿瘤蛋白的表达、与EGFR的交互作用、参与增强血管生成因子的作用及调节巨噬细胞产生细胞因子而介导肿瘤细胞的黏附及迁移。临床研究已证明，OPN的表达与肿瘤的恶性行为及转移有关，OPN被认为是多种实体肿瘤，如乳腺癌、胃癌、卵巢癌及前列腺癌等进展及生存率的预测指标，并且，OPN已作为基因治疗的一个靶点。近来的研究显示，血浆中的OPN水平与肿瘤患者肿瘤的氧合状态及治疗效果紧密相连，由于OPN在乏氧状态下表达升高，因此可以作为一种肿瘤乏氧的标记物。由于肿瘤的氧合状态是多种实体肿瘤放疗敏感性的一个重要的预后因子，因此，依靠OPN的水平来判断肿瘤的乏氧状况，从而预测肿瘤放疗的敏感性，具有一定的可靠性，并且，以OPN作为靶点来改善肿瘤的放射敏感性，具有一定的研究前景。

3.碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ）　研究已证明，CAⅨ是一种重要的与乏氧有关的分子标记物。这种跨膜酶可以催化可逆的二氧化碳水合为碳酸的过程，与酸碱平衡及细胞与细胞间的黏附有关。CAⅨ在细胞密度增加及乏氧状态下上调。许多研究表明，在子宫体癌、肾细胞癌等实体肿瘤的肿瘤组织中，CAⅨ均存在过度表达，而在正常组织中，CAⅨ常常缺乏。虽然目前关于以CAⅨ为靶点的改善放射敏感性的研究不多，但不久的将来，可能会有更多的研究证明CAⅨ在靶向治疗方面的意义。

综上所述，在临床放射肿瘤学方面应用分子生物学标记物作为预测预后的因子并作为可能的靶向治疗的靶点的研究正在不断地发展。虽然我们的总结涵盖了很多的相关文献及著作，但一些重要的研究正在进行，将来一定会得出更加令人欣喜的结果。

二、预测放射性损伤的分子标记物

在肿瘤的放疗过程中，不可避免地存在着正常组织的放射性损伤。许多情况下，正常组织的放射性损伤可能成为肿瘤放疗中的一个重要的剂量限制性因素，从而影响了肿瘤放疗的效果。因此，有效地预测放疗中正常组织损伤的分子标记物的研究极其重要。

随着分子生物学的飞速发展，放疗后正常组织损伤的机制日益明了。虽然在临床表现上，放疗后正常组织的损伤传统上应用了一个相对简要的时间点——放疗后90d，且将放射性损伤分为早期及远期效应，但过去20余年的研究结果却强调了正常组织的损伤是一个动态的累进过程，没有截断的时间点可以将急性与慢性放射效应分开。放射性损伤的发生从DNA损伤的分子变化开始，是一个辐射诱导的过程，也是细胞因子的环境发生变化、细胞间的交互作用发生变化、炎症细胞浸润，最终进入诱导修复及恢复的过程。放射线通过炎症细胞因子、纤维化的细胞因子及其他体液因子等，引发了被损伤的细胞与其周围微环境之间的交互作用。基础及临床研究资料均显示，局部及全身细胞因子表达的改变，是进行性发展的放射性炎症及纤维形成的整个部分。这些体液因素通过介导细胞与细胞间的相互作用、募集免疫细胞参与放射性炎症反应及慢性进行性的组织缺氧、永久的组织损伤及长期的纤维变性等过程，调整了宿主对放射性损伤的免疫应答。在动物模型中，放射性损伤已得到了广泛的研究，并且已识别出许多介导放射性损伤的关键的细胞因子，包括化学增活素及黏附分子等，如单核细胞趋化因子蛋白1、细胞间黏附分子1及干扰素诱导蛋白10等，均与早期的炎性渗出及炎症细胞、免疫细胞向放射损伤区域的迁移有关。炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子、白细胞介素6（IL－6）及白细胞介素1（IL－1）与辐射反应的炎症过程有关。纤维化的细胞因子，如转化生长因子（TGFβ）－1、基本成纤维细胞生长因子（bFGF）及血小板衍生的生长因子（PDGF）等与进行性的组织纤维化有关。另外，在放射性损伤发生时，还存在着辐射可诱导的基因分子标记物的变化。对大量接受放疗的肿瘤患者的研究证明，遗传因素决定了正常组织的放射敏感性。随着反转录聚合酶链反应及cNDA微阵列杂交技术的发展，高灵敏度的检测辐射诱发的mRNA分子生物学标记物已成为可能。在体外，人类外周血淋巴细胞被辐射，并且用分子生物学技术来测定辐射诱导的基因变化，鉴定出外周血淋巴细胞许多上调的基因，其中包括应激反应基因、细胞周期基因、DNA修复基因以及与凋亡途径相关的基因等。这些放射性损伤的基因分子标记物包括:GADD45A、CDKN1A（CIP/WAF1）、DDB2、MDM2、TRAIL受体2、DRAL（FHL2）、细胞周期蛋白G以及细胞周期蛋白基因等。在这些分子标记物中，接受全身放疗患者的全血提取物中GADD45A、CDKN1A以及DDB2增加。目前，将这些分子标记物转化为临床晚期放射性损伤的预测工具，以及作为放射的生物剂量的测定方法的研究正在进行中。近期的研究还证明了将放射性损伤的分子标记物作为新的对抗放射性损伤的分子靶点的靶向治疗的可行性，如阻断TGFβ^－1病理途径、抑癌基因p53途径及神经酰胺途径等。

综上所述，分子标记物不仅揭示了放射性损伤的发生机制，它们还可能是评估生物学剂量的重要工具，除了对处理急性放射性损伤非常重要之外，它们还可能为预测辐射事故或肿瘤治疗的长期后遗症提供补充手段。

总之，在临床放射肿瘤学方面应用分子标记物作为预测因子，并作为可能的干预治疗靶点的研究正在快速发展。虽然我们上面的论述涵盖了很多相关的研究，相信一些正在进行的重要研究将会带来更加令人振奋的结果。不久的将来，肿瘤分子标记物可能会成为放疗中临床决策的制订、靶向治疗手段的开发及放射性损伤预测的一个更新的、更有效的手段。

（王　丽）