单向免疫扩散实验

实验12　单向免疫扩散实验

(Single immunodiffusion test)

【目的】

了解单向免疫扩散实验的原理、方法及其应用。

【原理】

此试验属定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。实验中先将某种已知抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，将需检测的一定量的抗原加入孔中。在反应过程中，抗体已经均匀分布在琼脂板中，只有抗原向四周呈辐射状扩散，故称为单向免疫扩散试验。如果抗原和抗体相对应，则在比例适当的地方出现一白色的沉淀环。沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗体反应后测得沉淀环的直径作为纵坐标，以抗原的浓度作为横坐标可绘制标准曲线图。测出待测抗原在相同条件下的沉淀环直径，即可从标准曲线中求出其含量。此实验主要用于检测血清中各种Ig和补体成分的含量。

【材料】

1.标准参考血清:冻干正常人混合血清，其中IgG含量为经标准标定的已知量，用以制作标准曲线。

2. IgG诊断血清。

3.待检标本:人血清。

4. 1.5％琼脂盐水、PBS、载玻片、直径3mm打孔器、微量加样器、湿盒、半对数坐标纸。

【方法】

1.免疫琼脂板的制备:将适宜浓度的诊断血清与预先溶化好的并保存于56℃水浴箱中保温的1.5％琼脂盐水按一定比例混合后，立即浇注在载玻片上，每块3.5ml(厚度2mm)，置室温冷却凝固制成免疫琼脂板。

2.打孔:用直径3mm打孔器在琼脂板上打孔，孔间距为15mm，孔内琼脂用打孔器的针尖挑出。

3.加样:取冻干参考血清一支，加入0.5ml蒸馏水溶解，用0.01mol/L pH7.2～7.4PBS倍比稀释成1∶10～1∶160五种浓度。用微量加样器分别取10μl不同浓度的参考血清准确加入免疫板的孔内，每一浓度加2个孔，然后用同样的方法取10μl事先用PBS1∶40稀释的待检血清加入孔内，每份标本加2个孔。

4.反应:将加样的琼脂板置湿盒内，放37℃恒温箱24～48h后取出，测量各孔沉淀环直径并记录(图12-1)。

【结果】

以所加各种浓度参考血清的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中IgG浓度为横坐标，在半对数纸上作图，绘制标准曲线。根据待检血清的沉淀环直径，从图12-2上可查出IgG浓度。查得的浓度乘以标本的稀释倍数即可得该标本IgG的浓度。

图12-1　单向免疫扩散实验

图12-2　单向免疫扩散标准曲线

【注意事项】

1.制备琼脂板时温度不宜太高以免抗体变性失活，也不宜太低以免使琼脂凝固不匀。

2.制备琼脂板时，载玻片一定要置于水平位置。

3.孔要圆整、光滑，孔中琼脂不能与载玻片分离。

4.时间要适当。时间过短，沉淀线不能出现;时间过长，沉淀线解离或散开，影响结果判断。

5.测量沉淀环直径必须准确，以mm为测量单位。

【讨论题】

单向免疫扩散时，沉淀环直径的大小受哪些因素的影响?