实验18 溶血空斑实验
(Hemolytic plaque test)
【目的】
了解溶血空斑实验的原理及操作方法
【原理】
溶血空斑试验又称为PFC(plague forming cell，PFC)测定技术，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。
将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，4天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞(PFC)。然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。由于PFC所分泌的抗体和绵羊红血球结合形成抗原-抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
本实验可作为机体免疫状态的指标，研究药物对机体免疫功能的影响等特异指标。具有特异性高，筛检力强，可直接观察等特点。
【材料】
1.动物解剖器械、注射器(5m l)、平皿、中试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、盖玻片、双面胶、微量加样器和离心机等。
2.试管、1ml吸管、毛细滴管。
3.载玻片、用双面胶条制成的小室。
4.石蜡盘、酒精灯。
5.微量加样器及枪头。
6.小鼠。
7. 5％和15％绵羊红细胞(SRBC)。
8.豚鼠新鲜血清——补体(经SRBC吸收过)。
9.含5％新生牛血清的Hanks液。
【方法】
1.免疫小鼠及脾细胞悬液的制备:用5％SRBC 0.4ml(约4×106个)注射入小鼠腹腔，4天后拉脱颈椎处死，取出脾脏放在已加入6mlHanks液的平皿中，用100目的不锈钢网研磨后，经尼龙布过滤放入试管中，1000r/min离心5min，洗2次。将沉淀的脾细胞重悬Hanks液中，细胞计数并配成1×107/ml细胞浓度。
2.补体制备:新鲜豚鼠血清，经绵羊红细胞吸收后，用Hanks液配成1∶6～1∶8浓度。
3.绵羊红细胞(SRBC)制备:取脱纤维SRBC，用生理盐水洗3次，(每次1500r/min，10min)最后一次要2500r/min，15min，取压积SRBC配成15％的SRBC悬液。
4.制作小室:取无脂载玻片(75mm×25mm)，平置桌面上。用双面胶带在载玻片两端和中间各粘一条，然后再覆盖上同样的载玻片，即形成两个小室。将此双层玻片的一侧长边浸入融化的石腊池中以封闭小室的一边(无需浸入过深，以能封闭小室边缘为准)。
5.小室灌注细胞悬液:取1×107/ml脾细胞50μl，15％SRBC 50μl，1∶6～1∶8补体50μl，Hanks液250μl，混匀，用微量加样器将混合液注入事先制备好的小室中(每小室100μl)，然后以石蜡封口，放37℃温箱1～1.5h，取出观察结果。
【结果】
进行空斑计数，可肉眼直接观察或借助放大镜。计算1×106个脾细胞所含空斑数，即抗体形成细胞数。
【注意事项】
1.载物玻片、盖玻片必须洁净。
2.绵羊红细胞及补体要保持新鲜。
3.双面胶与盖玻片之间不要留有缝隙。
4.加样时勿产生气泡，勿使液体外溢。
5.小室边缘须用石蜡封严。
6.放37℃温箱培养时必须放平，不可倾斜。
7.观察空斑应注意与气泡区别。
【思考题】
1.PFC实质是什么细胞?
2.简述溶血空斑实验的原理及其实际应用。
3.在本实验中，绵羊红细胞有什么作用?
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