花环形成实验

实验25　E花环形成实验

(Erythrocyte Rosettes Assay)

【目的】

1.了解检测人外周血T细胞数量的原理及操作过程。

2.掌握E花环形成实验的方法，并能正确判定花环及计算花环形成率。

【原理】

人成熟T淋巴细胞表面的CD2分子，即为绵羊红细胞受体(ER)。在一定的实验条件下，绵羊红细胞(SRBC)可与人T淋巴细胞CD2分子结合，形成玫瑰花环，称为E玫瑰花环实验。E花环的形成是T淋巴细胞的独特标志。该实验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。

【材料】

1.淋巴细胞分离液。

2.肝素。

3.无Ca^2＋、Mg^2＋的Hanks液，pH7.2～7.6(见附录Ⅰ)。

4.阿氏液。

5.绵羊红细胞悬液: Alsever溶液保存的绵羊外周血以Hanks溶液洗涤3次，每次1500r/min离心10min。将压积SRBC配制成1％绵羊红细胞悬液。

6.吸收灭活胎牛血清，胎牛血清经56℃、30min灭活后，按每毫升胎牛血清中加洗涤过的压积绵羊红细胞0.1rnl，混匀，于37℃温浴30min，再经2000r/min离心20min，取上清液置4℃保存。

7. 0.8％戊二醛溶液。

8.瑞氏染液或姬姆萨染液。

9.华氏管、吸管、滴管、水平离心机、水浴箱、冰箱、显微镜等。

【方法】

1.取肝素抗凝血1ml，加Hanks溶液等量稀释后，沿试管壁缓缓将血加到盛有2ml淋巴细胞分离液之上，水平离心(2000r/min×20min)。

2.小心吸取分离液界面白色的淋巴细胞层，用Hanks溶液洗涤2次，每次1500r/min离心10min。弃上清液，用Hanks溶液调整细胞浓度至2×10⁶/ml(详见实验24淋巴细胞分离方法)。

3.取0.1ml淋巴细胞悬液，加入0.1ml已吸收灭活的胎牛血清，再加入1％SRBC悬液0.1ml，混匀，37℃温浴5min，离心(500r/min×5min)。然后置于4℃冰箱，至少2h或过夜。吸去部分上清液，轻轻旋转悬起细胞，沿管壁加1滴0.8％戊二醛固定细胞，置4℃冰箱静置20min。

4.轻轻吸取1滴涂片，待自然干燥后，用姬姆萨液染色或瑞氏染液染色，镜下观察。

【结果】

凡淋巴细胞周围结合3个或3个以上绵羊红细胞者即为E花环阳性。计数200个淋巴细胞中形成花环的淋巴细胞百分率。

正常参考值:为60％～80％，少于50％为降低。

【注意事项】

1.SRBC最好用新鲜的，一般采血后保存在Alsever液中，2周内可以使用，超过2周则与淋巴细胞的结合能力显著下降。

2.从采血到测定不得超过4h，否则CD2分子易于自行脱落。同时可用台盼蓝检查活力，活细胞应不少于95％。

3.计数前应将沉于管底的细胞重悬，但操作要轻柔，不能过猛或强力吹打，否则会使CD2分子丢失或减少。

4.SRBC与淋巴细胞结合形成花环后，操作更要轻柔，否则花环容易脱落。

5.SRBC与淋巴细胞的比例(E∶T)应以80∶1～100∶1为宜。

【思考题】

1.简述E-花环形成的原理。

2.什么是总花环和活性花环?为什么测活性花环比测总花环更有参考意义?