抗体介导的细胞毒实验

实验28　抗体介导的细胞毒实验

(Antibody-mediated cytotoxicity assay)

【目的】

通过实验加深对NK细胞作用机理的理解。

【原理】

在经聚-L-赖氨酸处理过的玻片上制备单层鸡红细胞后，加入兔抗鸡红细胞血清及纯化的人淋巴细胞，作用一定时间后，NK细胞周围的鸡红细胞被溶解，只剩下细胞核，在低倍镜下检查空斑数，即可算出NK细胞含量的百分数。

【材料】

1.鸡红细胞:取抗凝鸡血去血浆，用Hanks液洗三次，配成2.5％的细胞悬液(约1×10⁸细胞/ml)。

2.兔抗鸡红细胞血清:经56℃，30min灭活，可用组织培养液适量稀释(1/10⁴)。

3.淋巴细胞:从末梢人血中分离单核细胞，经吸附法除去大单核细胞后得到较纯的淋巴细胞。用含10％小牛血清的细胞培养液(RPM I1640)配成4×10⁶/ml的细胞悬液。

4.TH液:等渗的Tris缓冲液(Tris-HCl12.02g，Tris base2.65g溶于100ml双蒸水中，pH7.4)与Hanks等量混合。

5.聚-L-赖氨酸溶液(20ug/ml):用TH将聚-L-赖氨酸配成10μg/ml的母液，冷冻保存。临用时用TH液新配(取母液0.1ml＋ TH液49.9ml，使之成20μg/ml浓度)。

【方法】

1.单层鸡红细胞平板的制备:将酒精泡过的盖玻片置平皿内，滴加聚-L-赖氨酸溶液0.5ml使其均匀铺布后，置室温45min。吸取盖玻片上的液体，用TH液0.5ml洗盖玻片二次(不要弄湿平皿底)。取2.5％鸡红细胞悬液0.5ml均匀铺于盖玻片上，室温放置45min，向平皿内缓慢加入TH液并吸去，如此反复以除去未吸附于盖玻片上的鸡红细胞，最后在平皿内留少许液体(可置4℃保存3～4d)。

2.在低倍镜下检查制备的单层细胞玻片，弃去分布不均者。取0.5ml淋巴细胞悬液与0.5ml灭活的兔抗鸡红细胞血清混匀平铺于平皿中，另一平皿用正常兔血清代替抗体血清作为对照。将上述平皿置5％CO₂、饱和湿度的容器中，37℃培养20h。

3.取出平皿，滴加2.5％戊二醛水溶液1ml，0.5min后吸去平皿内全部液体，再沿平皿壁缓慢加入2.5％戊二醛2ml;固定5～8min后吸去液体。红细胞单层用蒸馏水漂洗二次，常规姬姆萨染色镜检。

【结果】

凡有5个以上被溶去细胞浆，只剩胞核的鸡红细胞集中在一起称为一个空斑(80％的空斑中有1～3个淋巴细胞)，即一个NK细胞。

计数1cm²红细胞单层上的空斑数(a)，量出平皿的总面积(b)，加入平皿内的淋巴细胞总数(c)，按下列公式算出NK细胞的百分率。

NK细胞百分率= ab/c×100％

本法测定正常人外周血淋巴细胞的NK细胞为2.5％～3.5％

【思考题】

1.何谓ADCC?

2.NK细胞与T淋巴细胞有什么区别?