微量淋巴细胞毒实验

实验29　微量淋巴细胞毒实验

(Micro-lymphocytotoxicity test)

【目的】

检测淋巴细胞上的HLA-A、HLA-B、HLA-C抗原，以确定HLA抗原型别。

【原理】

已知特异性的HLA抗血清，在补体存在下，对具有相应抗原的淋巴细胞具有细胞毒作用，使其细胞膜损伤，经染料染色，死细胞着色且体积增大。无相应抗原的细胞则存活，不着色，大小正常，由此可测出淋巴细胞HL-A、HLA-B、HLA-C抗原的表现型。

【材料】

1. HLA抗血清(一般均用市售商品，也可自制，但工作十分复杂，需要经过标准鉴定)。

2.对照血清:阳性对照为马抗人淋巴细胞血清;阴性对照为不含HLA抗体的灭活AB型人血清。

3.补体:以家兔补体最适用，其质量对HLA分型结果影响最大，美国el-Fieez公司产品较好。自制时用10只家兔自心脏抽血，单独分离血清，经检验对人淋巴细胞无毒性。混合后分装使用，－20℃冰冻保存，可用3个月。

4.淋巴细胞分离液、pH7.2Hanks液、肝素抗凝剂。

5. 5％伊红水溶液、中性福尔马林(37％甲醛于用前以1mol/LNaOH调pH值至7.2并配成所需浓度)、液体石蜡油。

6. HLA抗原分型试验板、定量加液器、显微镜。

【方法】

1.分离淋巴细胞，方法同前，调整细胞浓度(1.5×10⁵～2.0×10⁵/ml)。

2.用HLA抗原分型试验板，每孔注加液体石蜡5～10μl，按事先编号各孔中注加相应HLA抗血清1μl，设阳性对照孔和阴性对照孔，分别加入阳性和阴性血清各1μl。分注后此分型板可立即使用，也可－80℃冻存。

3.将细胞悬液充分混匀，每孔加入1μl(约2000个细胞)，轻轻摇动试验板，使血清与细胞完全混匀，20～25℃温育30～60min。

4.各孔加兔补体5μl，轻轻摇动使之混匀，20～25℃温育1h。

5.各孔加5％伊红水溶液2～3μl，混匀，室温放置5min，再于每孔加入中性福尔马林10μl固定和终止反应。经过1～2h后，吸取上清液计数。

【结果】

光学显微镜低倍镜检查，可见活细胞不着色，折光性强，发亮，大小正常。死细胞着色(粉红色或蓝色)，无折光性，体积增大。

倒置相差显微镜下观察，死细胞呈暗红色或黑色。

阳性对照孔死亡细胞数一般大于80％，如小于80％则需要找原因，重做实验。阴性对照孔死亡数一般小于10％，如大于20％也需找原因，重做实验。

【注意事项】

1.本实验要求HLA抗血清特异性强，需经HLA标准淋巴细胞鉴定，结果能准确重复。

2.淋巴细胞要求纯度高，活力好。血液的抗凝以用玻璃珠脱纤维为好，因淋巴细胞得率高，血小板少，为提高淋巴细胞得率，使用器具最好进行硅化处理。

3.操作要细心、精确，勿将液体溢出孔外，补体严格控制量为5μl。

4.由于HLA抗原存在交叉反应性，故进行抗原鉴定时，应根据3种以上同一特异性的抗血清检测的结果进行综合判定。

【思考题】

简述微量淋巴细胞毒试验的原理及操作过程中的注意事项。