混合淋巴细胞培养法

实验30　混合淋巴细胞培养法

(Mixed lymphocyte culturemethod)

【目的】

掌握混合淋巴细胞培养的方法和用途。

【原理】

混合淋巴细胞培养法(MLC)有单项法和双向法两种。双向MLC是直接将未经任何处理的同种异体淋巴细胞混合培养，如二者的组织相容性相互配合，则互相刺激作用很小，细胞无明显增殖;反之，若二者的组织相容性不配合，则互相刺激使细胞发生增殖分化，形态上出现母细胞的转化。

【材料】

1.混合AB型血清:由10名健康无输血史的男性AB型血清混合而成，56℃，30min灭活。

2.含15％～20％AB型血清的RPM I1640淋巴细胞培养液。［含AB型血清的RPM I1640营养液的配置: 1640液80ml、小牛血清20ml、L-谷氨酰胺(LG)母液1ml、青霉素与链霉素(PS)母液1ml、60.0g/L NaHCO₃3ml混匀，加入15％～20％AB型血清］。

3.淋巴细胞分离液、肝素抗凝剂、无钙镁Hanks液、生理盐水等。

4.显微镜、离心机、温箱、试管、毛细滴管、血球计数板、玻片、瑞氏染液等。

【方法】

1.淋巴细胞分离:取肝素抗凝血10ml用等量无钙镁Hanks液生理盐水稀释后轻轻加在淋巴细胞分离液面上，1500r/min离心20min，小心吸取淋巴细胞层。用足量不含血清的RPM I 1640液与上述淋巴细胞充分混匀，1000r/min离心15min，立即弃上清液，加适量含AB型血清的RPM I 1640液使之成浓细胞悬液，记录体积，取样计数，然后用含AB型血清的RPM I 1640液调整细胞浓度为1×10⁶/ml。

2.细胞接种与培养:分自身对照管和反应对照管，在反应管中各加供、受体双方淋巴细胞0.2ml(总量0.4ml，0.4×10⁶个细胞)。自身对照管中加同种细胞0.4ml(细胞总数相同)，加好后，用橡皮塞塞紧，置37℃培养6d。

【结果】

培养结束后轻轻取出，用毛细管吸取上清液，将沉淀物摇匀后，吸出，推片，瑞氏染色后镜检，计算细胞转化率，方法同淋巴细胞转化实验。

自身对照管的转化率应小于5％。

如果反应管的转换率小于5％即为阴性。

【注意事项】

全部过程应无菌操作，操作过程中须防止将一种细胞悬液带入另一种细胞悬液。

【思考题】

简述混合淋巴细胞培养法的原理及操作方法。