实验31 细胞毒性T细胞杀伤功能测定
(Cytotoxic T lymphocyte(CTL) killing function test)
【目的】
初步了解51Cr释放法测定杀伤细胞功能的原理与一般过程。
【原理】
能进入到增殖的细胞内，与细胞浆蛋白质牢固结合。当标记的51Cr细胞受到损伤或死亡之后，即可释放出51Cr。51Cr辐射γ射线。51Cr释放法即用放射性同位素51Cr标记靶细胞，将标记的靶细胞与CTL细胞共同孵育，CTL细胞发挥杀伤功能，使靶细胞的细胞膜受到损伤，从而使胞质内容物释放到上清液中，靶细胞51Cr释放量与效应细胞活性成正比，因此测定培养上清液中放射性强度可以判断CTL细胞的杀伤活性。
【材料】
1.铬酸钠(
):51Cr的物理半寿期为27.72d。
2.十二烷基硫酸钠(SDS):用无菌生理盐水配制成2％浓度。
3.靶细胞:实验时一般采用24～48h培养的靶细胞。
4.效应细胞:从人外周血(肝素抗凝)分离的单核细胞或小鼠脾细胞。
5.含15％NCS的RPM I 1640培养液及淋巴细胞分层液等。
【方法】
1.制备CTL细胞:按常规方法制备脾细胞悬液。用淋巴细胞分离液分离单核细胞，加入ConA刺激细胞。细胞浓度调整到1×107/ml。
2.靶细胞的制备与标记:取对数生长期的靶细胞，用Hanks液洗涤2次后用RPM I 1640培养液悬浮细胞，然后调细胞浓度至2×106/ml，取1×106/ml细胞0.5ml，加入51Cr 100uci混匀后置37℃、5％CO2温育2h，每30min轻轻振摇一次。用细胞培养液洗涤细胞3次后调细胞浓度至1×106/ml备用。
3.细胞毒试验:取上述CTL细胞悬液1m l置聚丙烯试管中，加入靶细胞悬液0.1m l，设相应对照管。
4.置37℃、5％CO2中培养4h后离心，每管取上清液0.5m l。
5.将上清液置γ计数器中，测定其放射性(cpm值)。
【结果】
测定每管cpm值，依下式计算:
注:自然释放管以1ml RPM I 1640培养液代替相应细胞悬液。
最大释放管以1ml 1％NP-40液代替相应细胞悬液。
【注意事项】
1.根据预试验确定效应细胞/靶细胞的最佳比例。
2.注意防护同位素放射性污染。
【临床意义】
此指标是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标，特别是可测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和疗效观察的指标之一。
【思考题】
哪些细胞具有杀伤功能?有何区别?
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