实验33 酶联免疫吸附实验
(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
一、酶联免疫吸附实验-直接法
【目的】
了解酶联免疫吸附试验直接法的技术原理，熟悉其操作过程。
【原理】
酶联免疫吸附试验是一种固相酶免疫测定方法。其基本原理是先将已知抗原或抗体结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标记抗体或抗原按一定步骤与固相载体上吸附的已知抗原或抗体进行反应。用洗涤的方法使在固相载体上的抗原或抗体与酶标记抗体或抗原形成的复合物与游离成分分开，加入酶反应底物后，在供氢体的参与下，发生显色反应。显色的程度与标本中受检物的量直接相关，可根据显色反应的深浅进行定性或定量分析。ELISA法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。常用的技术类型有直接法、间接法，夹心法和竞争法等，虽然各技术类型的方法不尽相同，但试验原理、特点及影响因素基本一样。本实验以酶联免疫吸附试验直接法为例，学习酶联免疫吸附试验。
【材料】
1.抗原溶液(纯化的人IgG)。
2.包被溶液(0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液): Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸馏水至1000ml。
3.洗涤液(0.02mol/L pH7.4PBS-0.05％Tween20)。
4.酶标抗体稀释液:牛血清白蛋白0.2g，加洗涤缓冲液至100ml。
5. HRP标记的抗人IgG抗体或酶标SPA(有商品出售):临用前经适当稀释。
6.底物缓冲液: 0.2mol/L Na2PO425.7ml，0.1mol/L柠檬酸24.3g/ml，加蒸馏水至100ml。
7. HRP底物显色应用液(TMB-H2O2系统):
取TMB(2mg/ml乙醇溶液) 0.5ml，加底物缓冲液10ml，0.75％H2O2溶液32μl。摇匀后立即使用。
8.显色终止液(2mol/L H2SO4溶液):取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％) 21.7ml。
9.聚苯乙烯塑料板酶标孔、100μl加样器和枪头、吸水纸、洗涤瓶、小烧杯、37℃水浴箱、酶标仪等。
【方法】
1.包被:将抗原用包被液稀释成1∶10万、1∶20万、1∶40万、1∶80万、1∶100万等五种不同稀释度，分别依次加入到六孔酶标板的第1～5号孔中，第6孔仅加入包被液，作为阴性对照，每孔加入100μ1，置37℃作用4h或2～8℃作用24h。
2.洗涤:取板，弃去孔中液体，将洗涤液注满孔中，静置3min后，弃去孔中液体。重复3次，于吸水纸上充分拍干，4℃储存备用。
3.加入酶结合物:取板，将根据酶结合物说明书提供的参考工作稀释度进行预试以确定稀释倍数，稀释好的酶结合物加入反应孔中，每孔加入100μ1，置37℃作用30min。
4.洗涤:取板，弃去孔中液体，将洗涤液注满孔中，静置3min后，弃去孔中液体。重复3次，于吸水纸上充分拍干。
5.显色:加入HRP底物显色系统溶液，每孔100μ1，37℃避光反应10～20min，其间观察数次。
6.终止反应:当第1～5号孔出现明显颜色变化或阴性对照稍有颜色变化时，每孔加入终止液50μ1终止反应，于20min内测定实验结果。
【注意事项】
1.正确掌握微量移液器的使用方法，吸液时将按钮按至第一止点，排液时应尽力将按钮按到底。
2.正确洗涤酶标板，加洗涤液时，勿使洗涤液溢出，以免流入周围孔中，造成交叉污染。
3.标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质而干扰结果。抗凝不完全的标本因存在纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，因此尽量不用抗凝血，尤其是肝素抗凝剂。
4.标本在4℃冰箱内放置过久，易导致血清IgG聚合，一般要求放4℃冰箱5d内完成测试。如需要保存一周以上，则需要置－20℃冻存。融解时需要上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。
5.如果本底对照孔OD值较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清等封闭。
6.对于底物显色溶液，应当在临用前配制，同时注意避光。底物作用时间以10～30min为宜。
【结果】
1.肉眼判定:明显显色者判阳性，否则判阴性。
2.酶标仪判定:采用反应底物的最大吸收波长测定OD值，本实验底物为H2O2，供氢体为TMB，最大吸收波长为450nm，因此应测定OD450值。
二、酶联免疫吸附试验-双抗夹心法
【目的】
了解酶联免疫吸附试验双抗夹心法的原理，熟悉其操作过程。
【原理】
本实验以酶联免疫吸附试验双抗体夹心法定量检测甲胎蛋白(AFP)为例，学习酶联免疫吸附试验。将含有抗原(AFP)的血清加入到已包被有特异性抗体(抗AFP抗体，多抗或单抗)的聚苯乙烯塑料微孔板中，二者发生特异性结合，再与酶(辣根过氧化物酶，HRP)标记的特异抗体(抗AFP-HRP，单抗或多抗)反应后，洗涤去除未反应的抗体或抗原，加入酶底物系统溶液显色，显色深浅与待测抗原的含量成正比。
【材料】
1.抗原溶液:人AFP。
2.包被溶液: 0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液。
3.洗涤液: 0.02mol/L pH7.4PBS-0.05％Tween20。
4.封闭液:含0.2％牛血清白蛋白的洗涤液。
5.抗AFP抗体。
6. AFP标准系列。
7. HRP标记的抗AFP抗体。
8. HRP底物系统溶液(TMB-H2O2)。
9.显色终止液2mol/L H2SO4。
10.酶标板、微量移液器、37℃水浴箱、试管\酶标仪等。
【方法】
1.包被:于聚苯乙烯塑料微孔板中，加入已用包被液适量稀释的抗AFP抗体溶液(1～10mg/ml)，100μl/孔，置37℃作用4h或放4℃冰箱内作用24h。
2.洗涤:取板，弃去孔中液体，将洗涤液注满孔中，静置3min后，弃去孔中液体。重复3次，于吸水纸上充分拍干，4℃储存备用。
3.封闭:取板，加入封闭液，150μl/孔，于37℃温育2h或放4℃冰箱过夜。
4.洗涤:取板，弃去孔中液体，将洗涤液注满孔中，静置3min后，弃去孔中液体。重复3次，于吸水纸上充分拍干。
5.加样:分别加入待测血清标本及AFP标准系列，100μl/孔，同时设置阴性对照孔，于37℃温育1h。
6.洗涤:取板，同步骤4。
7.加酶结合物:加入HRP标记的抗AFP抗体溶液，100μl/孔，于37℃温育1h。
8.洗涤:取板，同步骤4。
9.显色:加入HRP底物系统溶液，100μl/孔，于37℃温育30min。
10.终止反应:当标准系列孔出现明显颜色变化或阴性对照稍有颜色变化时，每孔加入终止液50μl终止反应，于30min内测定实验结果。
【结果】
1.肉眼判定:明显显色者判阳性，否则判阴性。
2.酶标仪判定:采用反应底物的最大吸收波长测定OD值，本实验底物为H2O2，供氢体为TMB，最大吸收波长为450nm，因此应测定OD450值。用酶标仪于450nm波长下测定各孔吸光度。对AFP标准系列以浓度为横轴，吸光度为纵轴，建立标准剂量反应曲线，根据上述标准剂量反应曲线采用点对点得到待测标本的AFP含量，或采用线性回归得到待测标本的AFP含量。
【思考题】
1.ELISA的原理是什么?
2.ELISA的优点及用途有哪些?
3.ELISA法用于检测抗原和检测抗体的类型各有哪些?各种方法有何特点?其临床应用如何?
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