斑点金免疫渗滤实验

实验35　斑点金免疫渗滤实验

(Dot Immunogold filtration assay)

斑点金免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验均以硝酸纤维素膜为固相载体，以免疫金为结合物。因其最大特点是简便快速，故统称为快速斑点免疫结合试验。

此两种试验的共同特点是:简便、快速、单份测定、可立等结果，除试剂外无需任何仪器设备，且试剂稳定。因此特别适用于急诊检验。但这类试验不能准确定量，所以主要限于检测正常体液中不存在的物质(例如诊断传染病中的抗原或抗体)以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质(如HCG等)。目前临床检验中已开展的项目有HCG、抗HCV和抗H IV等。新项目正在不断发展中。

【目的】

熟悉斑点金免疫渗滤试验的原理和方法。

【原理】

以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原-抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。20世纪90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验(dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA)，又名滴金免疫测定法(简称滴金法)。在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。

以双抗体夹心法为例。在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中的抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。

【材料】

1.渗滤装置:塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片。塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径0.4～0.8cm的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央，盒内垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。如此即制备成一渗滤装置(图35-1)。塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。

-1 DIGFA渗滤操作示意图

2.滴金法试剂盒:滴金法反应板、免疫金复合和洗涤液。

【方法】

测定操作以双抗体夹心法为例，具体步骤如下:

1.将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本1～2滴，待完全渗入。

2.于小孔内滴加免疫金复合物试剂1～2滴，待完全渗入。

3.于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入。

图35-2　DIGFA渗滤装置示意图

【结果】

在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应;反之，则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。

有将包被斑点由圆点改成短线条式的:质控斑点横向包被成横线条，如“－”;反应斑点纵向包被成竖线条，如“∣”;两者相交呈“＋”。这样，阳性反应结果在膜上显示红色的正号(＋)，阴性反应结果则为负号(－)，目视判断直观、明了。

【注意事项】

1.为了提供质控保证，用于抗原测定的试剂盒还应包括抗原参照品，相应的检测抗体的试剂盒应有阳性对照品。

2.滴金法的质量控制常采用在硝酸纤维素膜上点加质控点的方法。质控小圆点多位于反应斑点的正下方。

3.双抗体夹心法的质控点最好是相应抗原，若该抗原试剂不易制备或价格昂贵时，也可用SPA或针对金标抗体的抗抗体来充当。

4.间接法的质控点采用盐析法粗提的人IgG最为经济、方便。

【思考题】

试述斑点金免疫渗滤试验的原理。