哪些方法可以看到抗原与抗体反应

实验39　放射免疫分析技术

(Radioimmunoassay，RIA)

【目的】

1.掌握放射免疫分析技术的原理和方法。

2.了解放射免疫分析技术的用途和注意事项。

【原理】

放射免疫分析技术(radioimmunoassay，RIA)一般采用竞争结合分析技术。其基本原理为同位素标记的抗原(Ag^*)与待测抗原(或标准品)竞争性结合有限的特异性抗体，最终形成的Ag^*-Ab复合物的量与被测物的含量呈负相关。当抗体的量固定不变时，免疫复合物的形成就受到待测抗原量的制约。如反应体系中待测抗原含量高时，对Ab的竞争结合能力就强，Ag-Ab复合物的形成量就会增加，Ag^*-Ab复合物则相对减少;反之，当待测抗原含量低时，对Ab的竞争结合能力弱，Ag^*-Ab复合物的形成量即增多。

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)在胎儿生长发育过程中由卵黄囊和肝细胞合成，胃肠管细胞也可合成一部分。出生后逐渐减少，在成人血清中含量极微。原发性肝细胞性肝癌时AFP明显增高，可通过检测其含量协助临床诊断。

本试验将纯化¹²⁵I标记的AFP与样本内AFP混合，使二者竞争结合一定数量的AFP抗体，经处理后用γ计数仪计数¹²⁵I标记的AFP与抗体结合的数量。

【材料】

1. ¹²⁵I-AFP、AFP标准品。

2. AFP抗体(第一抗体)、第二抗体(兔抗人Ig)。

3.待测人血清、缓冲液。

4.免疫反应管、微量加样器、γ-射线闪烁计数器等。

【方法】

1.按表39-1加入各反应液于免疫反应管中，每份样品均作双份测定。

2.反应:先将反应管37℃温育30min，4℃再放24h。

3. B、F的分离:

(1)自4℃取出后加入第二抗体0.1ml/管，室温放置4h;

(2) 3000r/min离心15min，沉淀物为已结合的AFP抗原(B)，游离的AFP抗原(F)留在上清液中弃去。

4.测定:

(1)各反应管加第二抗体后未离心之前测定总放射性;

(2)离心并弃去上清液后，再测定沉淀物的放射性。

表39-1　AFP放射免疫分析加样程序

5.计算各管的百分结合率:

对照管(Bc)的非特异性结合率: Bc= Bc/(B＋ F)c×100％

标准品管的百分结合率: B= B/(B＋ F)×100％－Bc

样品管(Bs)的百分结合率: Bs= Bs/(B＋ F)s×100％－Bc

6.绘制标准曲线:以标准AFP含量为横坐标，标准管百分结合率为纵坐标绘图。

7.计算样品AFP含量。

【结果】

通常健康成人血清含微量AFP，其值低于25ng/ml。样本结果＜20ng/ml者，可基本排除原发性肝癌的可能性;介于100～350ng/ml之间者，必须进行随访，密切观察AFP的动态变化; 350～500ng/ml或含量有明显增高者，必须参考其他实验结果并高度警惕原发性肝癌的可能; 500～1000ng/ml且AFP含量在短期内不断升高，原发性肝癌可能性很大，建议作活检;大于1000ng/ml，且近期内含量迅速升高，结合临床可基本诊断为原发性肝癌。

【注意事项】

1. RIA测定AFP的范围为0～400ng/ml，最敏感段为0～100ng/ml，故受检血清AFP高于400ng/ml时应进行稀释。

2.各种抗原和抗体试剂应储存于2～10℃，禁忌冰冻。

3.第二抗体加入反应管并温育后，用肉眼检查反应液呈明显絮状沉淀时才能进行离心分离，否则需延长温育时间或增加第二抗体量。

4.严重溶血标本不能使用;血脂会使结果偏高，宜空腹采血。

5.¹²⁵I具有放射性，操作人员应注意防范。废弃物应按有关规定存放。

【思考题】

1. RIA的原理是什么?该试验主要应用于哪些方面?

2.试比较RIA、ELISA以及荧光标记技术的优缺点。