辛酸-硫酸铵法提取血清中的抗体

时间：2023-05-09 理论教育版权反馈

【摘要】：在酸性条件下，非IgG的蛋白成分，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清液中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清液，即可获得纯度较高的IgG。从血清纯化抗体的方法很多，本实验将采用辛酸沉淀非免疫球蛋白和硫酸铵沉淀免疫球蛋白两个步骤，从血清中纯化多克隆IgG抗体。辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀腹水或血清中的非Ig蛋白;当加入33％～45％饱和硫酸铵时，IgG可被沉淀。

实验42　辛酸-硫酸铵法提取血清中的IgG抗体

(Bitter ammonium sulphate extraction of IgG antibodies in serum)

【目的】

了解辛酸-硫酸铵盐析法纯化单克隆抗体的主要原理、方法、结果分析及实际应用。

【原理】

在酸性条件下(pH4.5)，非IgG的蛋白成分(包括白蛋白、部分Ig)，能被辛酸(caprylic acid)等短链脂肪酸沉淀，上清液中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清液，即可获得纯度较高的IgG。辛酸加入量因抗体的来源不同而不同，人血清为70μl/ml，兔血清为75μl/m l，小鼠血清为40μl/ml，小鼠腹水为33μl/m l。这种方法IgG的回收率可达到80％。

从血清纯化抗体的方法很多，本实验将采用辛酸沉淀非免疫球蛋白和硫酸铵沉淀免疫球蛋白两个步骤，从血清中纯化多克隆IgG抗体。辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀腹水或血清中的非Ig蛋白;当加入33％～45％饱和硫酸铵时，IgG可被沉淀。

【材料】

1.－20℃冻存的人血清，每组5ml。

2. pH4.0、60mmol/L醋酸缓冲液。

3. pH7.4、0.02mol/L PBS和pH7.4、0.2mol/L PBS。

4.辛酸和硫酸铵。

5. 0.5mol/L和3mol/L NaOH。

6.其他:每组漏斗两个、滤纸两张、100ml三角烧瓶2个、100ml量筒1个、50ml离心管2个、刻度吸管、吸管、pH试纸、透析袋。

【方法】

1.血清的处理:取-20℃冻存的血清，经定性滤纸滤过，加入4倍体积的pH4.0、60mmol/L醋酸缓冲液，并用0.5mol/L NaOH调pH至4.5。

2.辛酸沉淀非Ig蛋白:室温下每毫升样品稀释液加入辛酸25μl，边加边搅拌，持续30min后，1900r/min离心30min，去除上层悬浮物及沉淀，收集上清液。

3.硫酸铵沉淀Ig:经辛酸沉淀后收获的上清液用定性滤纸过滤于量筒中，按滤过液10份加入1份pH7.4、0.02mol/L PBS，用3mol/L NaOH调pH值至7.4。将液体移至三角烧瓶，置4℃磁力搅拌下，按每毫升混合液加入固体硫酸铵0.277g(45％饱和度)，继续搅拌30min，以1900r/min离心30min，弃上清液，收集沉淀物，将其溶解于pH7.4、0.2mol/L PBS中。

4.透析除去硫酸铵:将溶解液装入透析袋，自来水流水透析60min，移入pH7.4、0.02mol/L PBS中搅拌透析至透析液中无NH^4＋离子存在(透析24h，其间换液4次)。将所得液体加温处理(52℃，30min)，然后经1900r/min离心30min，上清液即为纯化的抗体液。

【结果】

所得IgG蛋白作适当稀释后用紫外分光光度计测OD₂₈₀值和OD₂₆₀值，根据下列公式计算

含量:

IgG蛋白含量(mg/ml)=(1.45×OD₂₈₀－0.74×OD₂₆₀)×稀释倍数。并计算每毫升血清得IgG多少mg。

【思考题】

1.蛋白质在溶液中的溶解度取决于那些元素?

2.有哪些因素可以影响本实验的结果?

附录:溶液配制

1. pH 4.0、60mmol/L醋酸缓冲液

　　　　　　　NaA₂: 0.146 g　　　　　　　　　

　　　　　　　NaA₂·3H₂O: 0.242 g　