细菌多重药物耐药性的分子机制

第八章　细菌多重药物耐药性的分子机制

细菌多重耐药性（MDR）是细菌在致死量的不同结构药物作用下仍能生存的能力，而这种剂量的药物是能消灭敏感菌株的。发生多重耐药性的一种重要机制是由多重药物转运蛋白所引起的药物主动外流。现已知有6种不同的多重药物转运蛋白：①ATP结合盒式转运蛋白（ATP binding cassette transporter，ABC）；②主要易化蛋白家族（major facilitator family，MFS）；③抵抗/结瘤/分裂蛋白（resistance/nodulation/division protein，RND）；④多重药物和毒性化合物挤压转运蛋白（multidrug and toxic compound extrusion transporter，MATE）；⑤药物/代谢产物转运蛋白（drug/metabolite transporter，DMT），其中包括小型多重药物耐药转运蛋白（small multidrug resistance transporter，SMR）；⑥多重药物内质体转运蛋白（multidrug endosomal transporter，MET）。药物外流系统在细菌多重耐药性中的重要性在真核细胞和原核细胞中都已得到证实。

许多细菌中的MDR转运蛋白基因严密地受到转录激活蛋白和阻抑蛋白的调节。目前已知的MDR泵基因转录激活蛋白均属MerR，AraC或LysR家族，而已知的MRD泵基因阻抑蛋白则有TetR，MarR或LacI家族。这些调节蛋白本身就可与许多结构相同但化学性质不同的药物结合，这些药物为其所调节泵分子的底物，或者这些调节蛋白可以作为胞溶性多重药物的传感蛋白，此种反应是诱导MDR基因的活化，或者是MDR转运蛋白数量增加的结果。这些可溶性的多重药物结合调节蛋白较之位于细胞膜的MGR转运蛋白在进行阐明多重药物结合机制的结构研究时更能易于控制。近年来，大肠埃希菌多重抗生素耐药性阻抑蛋白MarR、枯草杆菌BmrR激活蛋白和金黄色葡萄球菌QacR阻抑蛋白都已得到确定。

一、多重药物调节蛋白的结构机制

（一）多重耐药抗生素耐药性阻抑蛋白——MarR

大肠埃希菌转录调节蛋白在多重抗生素耐药性（Mar）调节子的调控上起主要作用。这种调节子包括MarRAB和多样转录的MarC基因，后者与MarB一样，能编码一种功能未明的蛋白质。Mar调节子决定对许多结构不同的医学上重要抗生素耐药性的Mar表型。MarA基因编码转录调节子MarA，MarA是AraC家族中的成员，而且主要决定Mar表型。MarA并不能与药物结合，但可活化60余种染色体基因的表达，其中也包括MDR泵基因以及Mar调节子。含有144个残基的蛋白质Mar在调节MarRAB操纵子的转录以及Mar基因的调节环路上起重要作用。与临床作用相一致的是，已证实多重抗生素耐药的大肠埃希菌的形成是由于MarR基因的突变造成的。MarR通过与MarRAB和MarC基因之间的两个区域（Ⅰ位和Ⅱ位）形成二聚体的结合而阻抑Mar RAB。Mar R与Ⅰ位的结合位于Mar RAB操纵子的－35和－10框之间，而且是阻抑作用所必需的。

Mar R是一种多重耐药性结合蛋白，它可因许多阴离子化合物的作用而使其与相应DN A部位的结合受到抑制。这些化合物包括2，4－二硝基酚、白花丹素（pumbagin）、甲萘醌（menadione）、水杨酸盐。Mar R与水杨酸盐、2，4－二硝基酚、白花丹素和甲萘醌结合的亲和力分别为500μM，250μM，250μM，800μM，而且均较其他MDR调节蛋白为高。

Mar R的晶体结构确定2.3A的分辨力，而且蛋白质表现一种新的α/β折叠方式。这种方式可以作为Mar R结构家族的代表。Mar R二聚体的每一亚单位都可分为两个功能区，即主要决定二聚化过程的N/C末端功能区（残基10～21和123～144）和含有翼状螺旋的DN A结合基序的中央球状功能区（残基55～100）。翼状螺旋表面强的正电荷电动势以及在DN A结合上所必需的残基（即α4上的R73；翼1上的R94和G95）均位于这一基序的事实，都支持认为这一功能区是一种DN A结合功能区，在结构上如果两个DN A结合部位并列势必干扰Mar R二聚体停靠于B－DN A，提示在结合DN A的过程中蛋白质、DN A或两者都必须发生结构上的改变。不过GN A转折研究显示，Mar R并不能使DN A转折，因而提示可能是只有蛋白质的结构发生改变。Mar R与DN A结合的机制有待于Mar R－DN A复合体结构的确定。

每个Mar R亚单位在结构上有两个水杨酸盐结合部位，它们均位于DN A结合基序，并且都是高度溶剂暴露性质的。其定位性质提示水杨酸盐的结合可能抑制DN A结合。Mar R在位置Ⅰ与水杨酸盐的接触包括残基T72和R86（N H1至Sal1羧酸盐氧，2.9 A）以及由P57的范德华（van der Waals）力相接触。位置Ⅱ结合的水杨酸盐则与Mar R残基A70和M74发生范德华相互作用，和与R77的静电接触（N H1至Sal2羧酸盐氧，4.4A）以及与Q42的氢键结合。Mar R结构中的溶剂暴露Sal1分子与晶格接触（lattice contact）有关，从而可以解释为什么在形成数据－质量晶体（data－quality crystals）时，需要有过量的水杨酸盐存在，根据与代表性两组分反应调节子的序列同源性，曾认为Mar R可受到磷酸化作用的调节，这种同源性包括两个保守性的天冬氨酸盐残基和一个赖氨酸残基，天冬氨酸残基之一则已被磷酸化。但是Mar R的结构似乎与这种可能性相违背。即在Mar R中最有可能的磷酸化部位D76系位于α－螺旋上。所以对于Mar R功能调节结构机制的了解仍只是初步的。

（二）MDR转运蛋白Bmr的正向调节蛋白——Bmr R

枯草杆菌调节蛋白Bmr R是能活化Bmr转录的Mer R家族成员，Bmr则是阳离子亲脂性化合物的MDR转运蛋白。转录激活蛋白的Mer R家族成员共有保守性的N－末端区，这种保守性N－末端区由螺旋－转角－螺旋（H T H）DN A结合基序，其后继之以绕线式螺旋功能区所组成。此种蛋白质的C－末端配体/效应结合功能区与各种转录共同激活蛋白分子有所不同，并可与之结合。具有278个残基Bmr R的C末端功能区可识别几种毒性阳离子亲脂性化合物，这些化合物也是Bmr R转运蛋白的作用底物。Bmr R可以与这些药物结合，如与罗丹明6G（Rhodamine 6G）的亲和力为0.8μM，与四苯磷（tetraphenylphosphonium，TPP＋）的亲和力为100μM。它与同多数其他Ber R家族成员一样，能与bmr启动子中的DN A位点结合，这些启动子位于－35和－10框之间，彼此之间间隔19个bp。Bmr R不论在有无药物存在的情况下都能以几乎相等的亲和力与这种DN A位点结合；不过在与药物结合时可通过使19个bp间隔区的再构型（reconfiguration）及与RNA聚合酶相互作用激活Bmr转录的上调。

1.BmrR的转录活化机制　BmrR的DNA－结合功能区中含有一翼状螺旋基序，由一HTH基序、α1和α2、两个翼状结构W1和W2所组成。其中W1由β2、间隔环和β3所组成；W2实际上是一种变形的次级——HTH基序，它在功能上可以作为一种规范式翼状结构，可与邻近的磷酸盐骨架相互作用。在二聚化中起关键性作用的长型反平行的绕线式螺旋将翼状螺旋连接至C末端的药物结合功能区。在几乎是所有的MerR家族成员中，这两种结构元件都可能是保守性的。BerR的C末端功能区含有一β－桶形折叠，这一折叠中含有8条β－链和两个侧翼α－螺旋。在BmrR－TPP^＋－DNA复合体中最为显著的特点为DNA的结构。这种DNA不仅可全面解超螺旋，并扭成50°，也可发生中央碱基对的碱基对裂解和碱基对的滑动。BmrR与每一对称性的DNA半位点（half－site）相接触，从而能明显地稳定分子构象，此种接触包括α2螺旋上残基降的9处结合、W1上的8处和W2上的2处结合。显然这些结合都是发生在磷酸盐骨架之上的。BmrR结合位点中央的这种大型局部再构型过程的最终结果是－35和－10元件的再次定位，使其构象与具有规范的17bp间隔区的启动子极为相似。

2.BmrR与TPP^＋的结合　BmrR的结构显示，每一亚单位都是在主要由C－末端功能区内残基所形成的袋状结构中与TPP^＋发生结合。在此功能区内与TPP^＋的接触包括F224和Y268的van der Waals结合、连接β7和α6的P144、E145和N146的羰氧接触，以及E253和E266静电结合。此外尚观察到位于邻近DNA结合功能区α3处E47′未所期料的作用，α3可关闭药物结合袋状结构的一侧，因而限制其进入袋中。E47′、E353和E266残基均与结合的药物间隔相等；E47′，E253和E266羧酸盐氧原子与最邻近TPP＋原子之间的距离均为4A；而与带正电荷的磷酸盐原子之间的距离则均为8A。E253在TPP^＋结合上的重要作用已通过诱发突变得到证实，但E47′和E266的重要性则尚未正式确定。由于对于apo BmrRDNA复合体的结构尚不清楚，故药物活化的全部机制仍属未知。不过apo BRC（BmrR C－末端）的2.7A分辨力结构可提供一些线索。与BmrR－TPP^＋－DNA复合体的BRC进行比较，apo BRC结构显示，当药物结合时，α6螺旋重新定位，使药物得以进入结合袋。可见与其他亚单位DNA结合功能区α3包装的α6可能是信号传导机制中的一种开关，其中也涉及α5绕线式螺旋。

（三）qacA MDR转运蛋白基因阻抑蛋白——QacR

qac位点包括qacA和多样转录QacR基因。它在MDR基因中是比较特殊的，因为它是由带有其他抗生素耐药性基因的质粒编码。QacA蛋白决定对一价和二价阳离子亲脂性消毒灭菌剂的耐药性，如四级铵化合物（quaternary ammonium compound，Qac）。QacR是一种多重药物结合蛋白，也是转录抑制蛋白TetR家族成员。在无药物存在的情况下，具有188个残基的QacR蛋白可阻抑qac多重药物转运蛋白基因的转录。这种转录阻抑作用是通过与qacA启动子下游的大型假性回文序列（IR1）的结合，从而遮盖其转录起始位点所致。这就说明QacR阻抑转录是由于阻碍RNA聚合酶－启动子复合体转换成实质性的转录状态，而不是阻止与RNA聚合酶的结合。QacR结合至一28bp位点上，这一位点的碱基对数目接近其他TetR蛋白所结合者正常碱基对数目的2倍。

QacR是因qacA操纵子与许多不同的阳离子嗜脂性药物的结合而诱生。这些药物中有罗丹明6G（R6G）、结晶紫（CV）和乙锭（ethidium）。Qac R与这些化合物的亲和力在0.1μM至5.0μM之间。能与QacR结合的药物位数甚多，其数目可能超过能与Bmr R结合者。而这两种调节蛋白多可结合R6G和CV。Qac R可以和许多二价阳离子药物结合，如dequalinium、pentamidine和chlorhexidine。QacR与多种药物结合的多样性使其能成为一种良好的研究多重药物识别的模式系统，近年来已经确定了Qac R－DN A复合体以及Qac R与6种不同的阳离子嗜脂性“药物”［R6G、乙锭、结晶紫、孔雀绿（MG）、小檗碱（berberine）、dequalinium］的结构。这些结构提供了有关MDR蛋白与多种药物结合的初视图形，这就不仅解释了Qac R的诱导机制，也可显示多重药物结合的重要特征。

Qac R结合至28 bp协同位点的结构显示这种DN A结合方式与Tet R有所不同，而是一对二聚体间的有效结合。由结构上可见，QacR是一种全螺旋形式的蛋白质，而且与Tet R一样，含有DN A结合H T H基序。这种基序包被于N－末端三螺旋的束状结构之中。识别螺旋α²插入沟状结构的深部。与Tet R不同的是，两个Qac R二聚体与启动子位点相结合，每一二聚体与位点的一半接触。只有沟状结构的主要部分与两个Qac R二聚体接触，其中有60余处与DN A接触，也包括许多操纵子决定的相互作用。虽然二聚体的每一亚单位定位于沟中主要部位的方式稍有不同。但每种特异性相互作用均可显示每一半位点上都存有假性正向重复序列。QacR结合DN A的结构虽不是弯曲的，却是明显的开展式的，有一平均扭曲度为32.1°，而且在其整个长度上有一开放式的主沟。

Qac R结合DN A的研究表明，二聚体的二聚体以协同作用方式与DN A结合。这种协同作用并非发生于蛋白质－蛋白质相互作用，因为二聚体间最为接近的接触为5.0A，协同作用的结合很可能是通过DN A的结构由B－DN A构象转变为在晶体结构中所见的高亲和力低度扭曲构型来完成的。

二、转运蛋白的广谱底物特异性

由传统的膜转运机制可知，转运蛋白首先是与转运蛋白的底物结合，然后发生构象改变，而使结合的底物在细胞膜的另一侧解离。由许多酶类中的研究得知。这些结合涉及蛋白质特异性原子相互作用。多重药物的结合部位就可确定这种相互作用。有些多重药物转运蛋白能转运为数甚多的小分子，例如，P－糖蛋白能转运数百种药物、染料、肽类和某些类脂等。多重药物转运蛋白除了能与各类底物相互作用以外，并可与各种结构不同的转运抑制物结合，其中多数可能是与转运蛋白分子中的相同结合部位结合，并通过竞争机制抑制转运过程。

必须指出的是，多种药物转运蛋白并不是非特异性的，而是多特异性的，虽然它们可以与许多不相同的分子结合，结构上相似的底物的转运功效并不相同，而结构上相关的抑制物在其抑制活性上差异很大。在许多多重药物转运蛋白中都已证实了许多点突变所引起底物或抑制物的特异性改变，这些蛋白质与常规底物特异性转运蛋白一样，确实可以形成与底物或抑制物分子之间的直接原子相互作用。重要的问题是何故多重药物转运分子能与许多无明显相似性的分子发生这种相互作用。近20余年来的研究得知，P－糖蛋白也是一种转运蛋白，而对其明显的广谱特异性则认为是这一蛋白质特异发生独特底物识别机制的结果。多重药物转运蛋白属于膜转运蛋白的5个家族，在这些家族中，如主要易化蛋白（major facilitator）SMR、M A TE和RND，药物的外流转运时常伴有氢或金属离子的内渗转运。包括P－糖蛋白在内的转运蛋白ABC超家族，转运过程是由ATP水解所启动。多重药物转运蛋白常与正规的底物特异性转运蛋白同源。例如革兰阳性细菌的3种高度同源的多重药物转运蛋白BmrR、Blt和NorA与革兰阴性细菌的四环素特异性转运蛋白Tet A、B、C共有很高的序列相似性，而且此种序列相似性较之与同一家族中的主要易化蛋白，如MdfA、LmrP或QacA的序列相似性更高。这种在转运蛋白的进化过程中所获得识别多种化合物的能力，并不需要有转运蛋白结构上的巨大变化。

三、多重药物转运的机制

传统上对于多重药物转运蛋白的研究多采用生物化学、动力学和突变分析等方法，因而对于底物识别过程只能获得片面的了解。例如有关突变的研究发现有许多转运蛋白的氨基酸残基与带有电荷的细胞膜内残基的底物相互作用，在转运过程中至关重要。但是这些发现与多种药物转运蛋白的结构并不相关。

近期在多重药物转运机制上的研究获得若干直接的结构信息。P－糖蛋白膜结晶的低温电镜在10A分辨力下显示，有一由穿膜螺旋所构成的大型膜内槽形结构。这种槽形结构面对膜质有两个侧孔，通过此孔底物可进入槽内。早期研究提示许多转运蛋白底物是由膜的内侧向外转运，而不是由细胞溶质中排出。一旦ATP与P－糖蛋白的细胞内ATP酶功能区相结合，穿膜螺旋的包装上发生巨大的变化，导致入口侧孔关闭。这种ATP诱发的螺旋结构重新包装与转运蛋白和其底物亲和力的下降相关，而且引起已结合的底物解离至细胞外介质。当ATP水解和ADP和磷酸盐解离后，转运蛋白分子恢复其与底物具有高亲和力的原有构象。

应用4.5A分辨力的晶体学分析研究P－糖蛋白的密切相关细菌性同源物MsbA，则可获得更为仔细的结构资料。MsbA与类脂A的穿膜转运有关，也是细菌细胞壁形成的前体物质。研究中发现有一由12个穿膜螺旋所形成的大型槽状结构，且与P－糖蛋白一样，在膜的内侧也有两个侧孔，可以认为类脂A分子是通过内面的侧孔进入槽中的，然后在细胞内ATP酶功能区发生ATP结合或水解。

四、可溶性多重药物识别蛋白的结构分析

多重药物转运蛋白结构研究的主要障碍为其疏水性。但是也鉴定出许多可溶性的多重药物识别蛋白。而且近年来最少已确定了其中的5种，它们多以脱辅形式（apo form）或以与配体形成复合物的形式存在。

BmrR是这类蛋白质在功能上与多重药物转运蛋白有关的一种。如前所述，它是枯草杆菌多重药物转运蛋白Bmr转录调节蛋白，在其与多种无关的疏水性阳离子结合后能活化Bmr的表达。最近证实了BmrR的C－末端诱导物结合功能区的结构，是以脱辅形式与两个诱导物形成复合物的形式存在。同时也证实了全长BmrR结构系结合至Bmr基因操纵子，并与一诱导物形成复合物。最近对多重药物转运蛋白的转录调节蛋白QacR进行了更为细致的结构研究，发现QacR结构是与6个不同的配体形成复合物。另有两个多重药物识别蛋白为能氧化许多疏水性底物地细菌性细胞色素P－450和哺乳动物细胞色素P－450的转录调节蛋白PXR。最后的一个这种蛋白质为哺乳动物增味剂结合蛋白。这种蛋白质表达于畜牧动物鼻黏膜，可能作为捕捉蚊蝇的有机引诱剂。它能与多种不同的疏水性配体结合。

在以上的5种情况中，多种配体结合的机制是相同的，即首先是配体穿透至蛋白质深部的袋状结构中，在此与周围的疏水性残基发生许多范德华相互作用。启动结合的主要力量是一种疏水性效应，即配体在袋状结构内掩盖其本身，而不是成为溶液状态，在此状态下配体必须破坏水分子间氢键网络。在Bmr R和QacR中，带正电荷的配体和带负电荷的蛋白质残基间的静电吸引力能进一步增强结合。结合部位的疏水环境使静电吸引力特别强大，因其不受水极偶作用的保护。更为重要的是在所有情况下，结合袋的体积较大，足够使不同的配体分子获得不同的定向，以及与形成袋壁的不同残基相互作用。在很多情况下，Bmr R、细胞色素P450、PXR、Qac R的诱导物结合功能区袋壁某些部分是柔性的，在与配体结合后能改变其构象，因而能使与配体的结合范围加大。

上述结晶学研究证实，多重药物识别是一种简单的过程，并不涉及特殊的分子机制。酶类为了有效地与底物结合，必须克服许多水分子与溶解的底物所形成的强键的严重竞争。蛋白质克服这种竞争的可靠方式，是将能与底物结合的集团置于能与底物分子的分子特征建立最佳空间配合的位置上。只有在这种情况下才有可能使氢键、静电键以及底物与蛋白质间疏水性相互作用集合作用较之底物与水分子所形成的键接更强。这种“锁与钥”原则得以使底物与配体能有效的结合，同时也可主导高度的底物特异性。

相反，蛋白质结合疏水性配体不能在结合时与水分子竞争；它们只是在结合部位构成一种疏水性的环境，形成较好的结合亲和力。且可为结合部位的带有电荷残基的静电吸引力进一步增强。就这些蛋白质而言，配体特异性并不是结合机制的固有特征，另外也不是所有能与疏水性底物结合的蛋白质都表现广泛的底物特异性。如果结合部位大小有限，或者配体进入结合部位时需要某些结构上的重排，则只有特异性配体方可结合至蛋白质。这种情况可在能与前列腺素特异性结合的一些酶类中观察得到。但是，如果结合部位较大，且具有柔性的壁可供伸展，则许多不相同的分子都可在结合部位占有一席达到形状配合要求之地。同时即令配体结构稍有改变，如有另一甲基集团附于结合部壁，亦可有效地防止结合，有产生多种特异性，而不是结合过程的全部无特异性。

五、有关多重药物转运蛋白中的难题

多重药物转运蛋白和多种配体识别蛋白的特性上有很多相似之处。这两类蛋白质都是多特异性，而不是无特异性。两者的突变都可引起配体和底物亲和力变化。如在Bmr R诱导物结合功能区的突变引起对不同诱导物亲和力的变化；蛋白质突变型与野生型蛋白质相比较，对一些诱导物的结合较好，而对另外的一些诱导物则较差。另外，多重药物转运蛋白转运多种药物的能力取决于细胞膜内某些带有电荷残基的存在。特别明显的是，多重药物转运蛋白Mdf A转运带正电荷药物的能力，可以因为电子中性残基为带负电荷的谷氨酸所替代而完全消失，但对电子中性氯霉素的转运则无影响。所有的这些均提示多重药物转运蛋白的结合部位和可溶性多重药物识别蛋白一样，均以基本上相同的方式进行组构。

动力学研究证实，有的转运蛋白多重药物结合部位能同时结合两种不同的底物或抑制物分子。有关P－糖蛋白及其同源物MsbA的研究均证实在转运蛋白分子内有一大的空槽存在，在转运时底物可通过此槽。在MsbA的情况下，槽壁主要由疏水性残基和少数带正电荷的残基所形成，很可能是作为带负电荷的类脂A分子的吸引剂。

多重药物转运蛋白具有较大的疏水性结合部位的事实有助与解释何故无关的多种药物转运蛋白常可与相同格式的底物和抑制物结合，也可解释一些进化上的难题。转运蛋白在进化过程中可以由多重药物结合转变为配体特异性结合。Beste等对形成多种配体识别蛋白lipocalin的结合袋状结构残基进行随机诱变，经过几轮的噬菌体展示的选择后，获得了几种蛋白变异体，这些蛋白质对某些亲水性荧光素衍化物具有纳摩尔水平的亲和力和高度的特异性。在这种人工的进化过程中。荧光素结合变异体在其结合袋状结构内获得了几种完全改变其底物识别方式的带电荷的残基。此项工作证实，如能提供功能支架，则进化过程中获得具有极不相同底物特异性的蛋白质并不困难。很有可能，“疏水性”和亲水性底物识别方式的转变已多次在细胞膜转运蛋白不同家族的进化中发生。

疏水性结合部位的理论可以解释多重药物外流的秘密，细胞质内疏水性分子的数目极其有限，其所存在者，如某些维生素或脂类代谢中的前体分子与蛋白质紧密结合，以防止其通过类脂双层向外扩散。可能也并无进化上的压力促使转运蛋白特化转运疏水性分子，较为特异的是，其结合部位也不是简单地在几何学上配合仅与少数必须保存于细胞内的主要分子相结合。这也就是何故当细胞被疏水性药物冲击时，有许多外流转运蛋白，其结合部位能彼此协调，因为这些转运蛋白从来未被选择，以致不能转运这些外源性分子。

（余传霖）

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