分枝杆菌感染中的细胞免疫应答

第十二章　分枝杆菌感染中的细胞免疫应答

自从Koch发现了结核分枝杆菌以后，在临床和实验室内对于细菌与宿主之间相互关系方面进行了广泛的研究。这些研究不但给对结核病发病机制的了解上提供线索，也可因而明确分枝杆菌感染中的细胞免疫应答（CMI）机制。Koch曾提出，为了有效地设计结核病的预防措施，必须了解结核分枝杆菌的“生活状态”，即其在体内是否死亡的情况。已知结核分枝杆菌可在人体内死亡，而且引起其死亡的是获得性抵抗力的作用，但对两者之间的联系则了解不够。其中亟待解决的问题是了解细胞内寄生的分枝杆菌如何在人体内被杀灭。

一、结核病的发病机制和细胞免疫的诱导

通过对人类肺结核（主要是死后的）及实验动物（主要为家兔和豚鼠）的观察，使研究者对结核病的发病机制有所了解。如含有活的结核分枝杆菌的气溶胶化液体微滴被从未接触过细菌的个体吸入后，多数的细菌在气道中被清除，但也有仅含1～2个细菌的最小微滴被所存在的肺泡巨噬细胞吞噬。在此种原发性感染部位（常为单一性的），结核分枝杆菌可在细胞内繁殖。约2周后，通过淋巴管和血管的运送，使在吞噬细胞内细菌播散，而形成续发性感染部位。与此同时即可产生免疫应答。可用皮肤结核菌素变态反应检测。续发性感染部位中的免疫应答在以后的4周内，可导致显微镜下结节形成，同时并伴有细菌数目的减少。

然而在原发性或继发性感染部位中很少是完全无菌存在的，有时甚至可以终身存在。虽然活菌可以持续存在于感染的原始部位，但此时宿主对重复感染是有免疫力的，能迅速地消灭任何被吸入的新的结核分枝杆菌。针对重复感染的免疫反应性和免疫力取决于宿主体内活菌的持续存在。一旦感染中完全无菌，如在进行了严格有效的化学治疗时，免疫力和超敏反应可在数月内消失。换言之，免疫力是伴随性质的，而不应仅视其为一种长期的回忆反应。然而多数感染者至死以前均无症状表现。只有少数宿主的免疫状态改变，为轻度的改变，如在老年人或营养不良者中感染可复发。结核杆菌可在免疫力下降的情况下复制，使抗原量增加。感染部位炎症细胞因子和白细胞产物的产生引起局部坏死，此时就出现肺结核的临床症状。肺组织的破坏和出血可导致肺功能丧失和呼吸窘迫，全身症状则有发热、盗汗和结核病。病人可因一种或多种这些症状而死亡。

（一）人类结核病中结节形成的形态学

除了结核菌素超敏反应外，另一结核分枝杆菌感染反应性和抵抗力的标志为结节的形成，结节是结核病中的一种特殊的肉芽肿病变。有关肺结核发病机制的了解多来自感染部位结节形成的形态学研究。结节是由于在各个淋巴因子诱导的分化阶段中，T细胞和单核细胞快速、大量和持续地动员和移动至含有活化淋巴样和髓样细胞的部位而形成。这些细胞包括新近移入的单核细胞、组织中巨噬细胞、上皮样细胞，乃至多核巨大细胞。在肉芽肿形成的中期，成纤维细胞包绕隔离病变部位。结节有别于其他肉芽肿的特征为液化与中央空洞形成。空洞形成是大量组织坏死，以及在此部位发生细胞介导细胞毒反应和淋巴因子产生的后果。结核分枝杆菌可在液化区域的细胞外部位和组织巨噬细胞及多核巨大细胞内发现。这一系列的发展过程系由结核分枝杆菌的抗原所驱动，而且只有在对抗原刺激发生反应的个体中方可查见。因为最终的结果是细菌的繁殖可以得到控制，故这些反应可能决定针对分枝杆菌的获得性抵抗力。

（二）人类对结核病的获得性抵抗力

接触了结核分枝杆菌的人群常被感染，但其中只有少数表现有临床症状，而其中有半数在无任何治疗的情况下死亡于结核病。人在吸入了5～200个细菌后即可发生进行性的疾病。就对感染的易感性而言，人类对结核杆菌的感受性介乎豚鼠和小鼠之间；如豚鼠在感染了1～5个活菌后即可发病和死亡；小鼠不是结核分枝杆菌的天然宿主，它在静脉接种了1.5×10⁷个细菌后仍可不发生感染。然而，不论是在动物模型或在人类疾病中，感染的发展与宿主的免疫状况密切相关。

（三）CD4＋T淋巴细胞与抵抗力

致敏CD4＋T细胞易于在接触了分枝杆菌的人体内检出，如用体外针对分枝杆菌抗原的母细胞生成反应或体内结核菌素超敏反应，这两种反应都是由CD4＋T细胞所介导的。在已消除了感染的个体及有轻度病理变化的病人中，这两种反应都表现明显。有两方面的可靠事实提示CD4＋T细胞在人类结核病的抵抗力上起重要作用：①在晚期或疾病不能控制的病人中T细胞应答与疾病的发展表现为负相关关系，如在疾病发展时，体外对分枝杆菌抗原的母细胞生成反应降低和体内皮肤结核菌素超敏反应降低或消失。②人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的个体对于结核病有极高的易感性。此种病人在其他条件致病性感染发生之前，和在病人的CD4＋T细胞明显下降以前即已被结核分枝杆菌感染，提示T细胞群体至关重要，其轻微的变动即可改变对结核病免疫力的微妙平衡关系。经分枝杆菌抗原刺激后的致敏供血者体内分离出的CD4＋T细胞或其克隆，都证实可以分泌出大量的γ－干扰素（IFN－γ）。在这些供血者的外周血单个核细胞（PBMC）中，尚可鉴定出有分枝杆菌抗原特异性的主要组织相容性复合体（M H C）Ⅱ类限制性CD4＋细胞毒T淋巴细胞（CT L）存在。但是，CD4＋T细胞的不同细胞亚群的相对重要性以及其所介导人类中抵抗力的机制仍不清楚。

（四）CD4－淋巴样细胞与抵抗力

一般认为CD8＋细胞毒T细胞在人类感染中并不起关键性作用。其他的CD4－细胞群体则能对分枝杆菌抗原发生较强的反应，可以从致敏的供血者体内分离出对纯化蛋白衍化物（PPD）起反应的CD4－CD8－T细胞受体γ－δ（TCRγ－δ）^＋T细胞，已证实在人类分枝杆菌感染的肉芽肿病灶中，其中也包括结核样麻风病变，也有TCR－γ－δT细胞存在。与在小鼠中所见的情况相似，大部分重排和识别群体较之TCRαβ＋T细胞更为有限的外周血TCRγδT细胞，可对分枝杆菌抗原发生反应。其中有的细胞尚能识别分枝杆菌的热休克蛋白，并能与其人类同源物发生交叉反应。巨噬细胞能有效地提呈分枝杆菌抗原，特别是来源于活菌中的抗原，以活化γδ＋T细胞。人类TCR－γδ＋T细胞介导细胞裂解活性，并与已被感染的巨噬细胞发生反应，分泌细胞因子，特别是IL－2和IFN－γ。

在正常致敏的供血者体内也可分离出对分枝杆菌起反应的CD4－CD8－TCRαβ＋T细胞。这些细胞也可在非限制性的方式下识别由单核细胞呈递的分枝杆菌抗原。在此情况下的抗原呈递分子已证实为由细胞因子在单核细胞上诱导的非多态性CD1β，并且受到热休克和热休克蛋白存在的调节。因此。CD4－CD8－TCRαβ＋和CD4－CD8－γδ＋T细胞都被提呈分枝杆菌抗原的单核细胞活化，且均可裂解此种单核细胞。它们均证实为细胞因子，特别是IL－2和IFN－γ的有效来源。也有事实证明这些细胞抗感染抵抗力上的作用。虽目前尚缺乏直接的事实依据，但有关这些细胞在感染中作用的探讨成为研究活跃领域之一。

（五）巨噬细胞在人类结核病中的作用

巨噬细胞是在人类肺结核中首先被感染的细胞，因而在疾病中起重要作用。此种细胞如何与细菌相互作用就成为了解抵抗力的关键性问题。在小鼠中，能与分枝杆菌发生反应且可产生细胞因子的细胞。特别是CD4＋T细胞，可介导感染巨噬细胞的活化。然后活化的巨噬细胞可杀灭细胞内的细菌。在已接触的人体内可以证实有分枝杆菌反应性和产生巨噬细胞活化细胞因子的T细胞存在。不过单核细胞则未被证实可被活化，或可抑制细菌的繁殖。更不论可杀灭细菌。也未证实所分泌的活化巨噬细胞的细胞因子或与活化T细胞的相互作用，能在体外感染的巨噬细胞中诱发有意义的抗分枝杆菌活性。

单核吞噬细胞除了作为一种宿主细胞能支持分枝杆菌的细胞内生长及其有效的限制细菌生长和杀灭细菌的能力以外，尚可产生和释放在疾病免疫病理上起重要作用的炎症细胞因子。当这些细胞接触了结核分枝杆菌后可以产生肿瘤坏死因子－α（TNFα）、IL－1、IL－6、IL－8以及其他细胞因子。活动期肺结核病人PBMC所释放的TNFα较之经治疗无症状的结核病人及正常对照供血者为多。其结果是在活动感染病人血清中可以检出有病理性水平的TNFα。TNFα及其他炎症细胞因子在结核病免疫发病机制中的重要作用曾在小鼠模型中得到证实。TNFα在分枝杆菌感染中的肉芽肿应答形成上是必需的。但是高水平的TNFα可通过直接作用于下丘脑而诱发发热，此外动物中长期使用TNFα时，可导致脂肪和肌肉细胞消耗，形成全身性恶病质。这些症状构成了结核病的免疫病理，再加上TNFα相关性肉芽肿应答和坏死中的肺功能降低和组织损伤，最后可导致病人死亡。

二、感染单核细胞与T淋巴细胞的相互作用

粗制分枝杆菌制剂，如PPD对人的T细胞是一种很强的免疫原，能诱发CD4＋T细胞的母细胞生成反应，提示在致敏供血者中有较高比例的细胞是分枝杆菌特异性的，而且分枝杆菌抗原能有效地为抗原呈递细胞所提呈。此外，主要为CD4＋表型的分枝杆菌反应性CTL易于在经BCG免疫接种的供血者体内生成。为了研究CD4＋T细胞在降低细菌生活力的作用。Molloy和Kaplan探讨了慢性感染单核细胞与致敏前细胞、记忆性T细胞及活化CTL之间的相互作用。

（1）慢性感染单核细胞在T细胞活化中不能有效地提呈抗原。来源于BCG免疫接种供血者的感染和未感染的单核细胞在分离后的不同时间内，与新鲜分离自体的纯化CD4＋T细胞共同培养，并检定其母细胞生成应答。然后比较细胞内活的BCG抗原呈递和不能生长的可溶性分枝杆菌抗原混合物PPD的呈递。结果发现，新近感染的单核细胞能有效地提呈感染接种物中的抗原，而且BCG抗原和存在于PPD中的可溶性抗原同样有效地被提呈。如果单核细胞在感染后培养7 d，使细胞内生长的细菌数有10～50倍的增加，然后再与CD4＋T细胞共同培养，此时则很少有母细胞生成反应。相同的慢性感染单核细胞也能有效地呈递存在于PPD中的可溶性抗原，这种抗原是与T细胞和未感染单核细胞的平行培养同时加入的。因此，即令慢性感染细胞中的抗原呈递机制完整无缺，来源于细胞内BCG中的抗原不能有效地被呈递。因为抗原不能由感染的单核细胞转移至其他的抗原呈递细胞。所以在慢性感染吞噬细胞周围的抗原为数极少，不足以活化T细胞。

（2）慢性感染单核细胞不能有效地呈递可为CT L识别的来源于细胞内细菌的抗原。Molloy等也研究了抗原特异性M H C限制的CT L对于慢性感染单核细胞的裂解。抗原特异性CT L是通过BCG免疫后的供血者PB MC与PPD共同培养7 d后而生成。在有或无PPD或活的BCG存在的情况下，分析慢性感染的自体单核细胞和未经感染的单核细胞的裂解。结果发现，未经刺激的PBMC仅与培养基共同培养时，并不能裂解任何种类的单核细胞群体。为未经感染单核细胞所呈递的PPD或活的BCG则可被识别而裂解。在有PPD或BCG存在的情况下，感染细胞和未感染的细胞能够有效地被裂解。而在无外源性抗原存在时，慢性感染单核细胞的识别并不十分有效。由此可见，来源于细胞内细菌的抗原与检定时加入的可溶性或颗粒抗原相比较，不能有效地被提呈。新近感染或抗原致敏单核细胞的裂解是M H C限制的。

（3）淋巴因子活化杀伤细胞对慢性感染单核细胞的识别。BCG感染的人类单核细胞虽不能为CD4＋T细胞有效地识别，但却易于被IL－2活化的淋巴因子活化杀伤细胞（L A K）所识别和裂解。当抗原依赖性的T细胞识别消退时，L A K细胞对于感染单核细胞的识别就有所增加，提示此种类型的细胞可以起到辅助性的作用。BCG感染细胞的选择性识别是同系和同种异体L A K细胞所介导的，而不是由于分枝杆菌的呈递所致。此时的识别和杀灭却与慢性感染有关。

分枝杆菌抗原，特别是活的BCG细菌是体外L A K活性的强刺激物，可能是由于T细胞和其他淋巴样细胞接触细菌后所产生的高水平细胞因子所致。在体外，虽然PPD是一种诱发母细胞生成的良好丝裂原，但活的BCG则能稳定地诱发高水平的L A K活性。这可能是由于BCG能诱导高水平IFN－γ产生，而IFN－γ可以和IL－2一起激活L A K活性。用活的BCG免疫后可在实验动物体内证实有L A K细胞生成。

慢性感染或细胞内复制细菌的存在可使宿主编码的某些表面结构发生改变。未感染的单核细胞接触了热休克后并不能使其为L A K细胞的识别增强。提示可能的改变自身分子并非热休克蛋白。有人曾提出，在某些肿瘤细胞株和病毒感染细胞上M HC－Ⅰ类分子表达的下调可使这些细胞对N K细胞裂解活性易感。这方面的重要性并不明显，因为感染和未被感染细胞上的M H C－Ⅰ类分子表达相似。

体外L A K活性的生成需要高度水平的IL－2。一般在体内无法直接检测细胞因子的浓度，但在肉芽肿中则较易检出，因细胞因子在此结构中易于隔离和浓缩，因此，分枝杆菌感染的部位可以成为LAK细胞生成的理想微环境。

三、感染单核细胞的凋亡

过氧化氢和ATP^4－处理可在体外杀死感染的单核细胞。据报道，这些介质杀死细胞有不同的机制。过氧化氢诱导的细胞死亡是通过继之细胞膜损伤后而发生的胶体渗透作用，是一种坏死机制。ATP诱导的细胞死亡则伴有DNA断裂和核质凝聚，这些都是凋亡的生化和形态改变特征。ATP^4－所致的人类单核细胞的程序细胞死亡是一种生理过程，是由发生于细胞表面上ATP^4－受体上启动的信号传导过程而发生的。ATP^4－在许多细胞死亡后释出，也可在诱发靶细胞凋亡性死亡的细胞毒淋巴细胞中释出。

BCG慢性感染的细胞发生凋亡时，细胞内细菌的生活力消失60%～70%。因为细菌在细胞内的倍增时间为20～40h，在6h内细菌数能有3倍的减少，提示的确是有细胞内细菌的直接杀灭，而不是简单的生长停滞。因为细菌数目的减少只有在细胞发生凋亡的情况下产生，而不是在APT4处理以前裂解，杀灭显然特异地与凋亡过程相关。

在感染单核细胞发生凋亡死亡时，常伴有细胞内囊泡系统结构上的改变，即原为分散存在的为细菌寄生的囊泡发生融合。一般认为分枝杆菌对巨噬细胞杀菌机制的抵抗力与细菌的改变其本身所在细胞内环境的能力有关，特别是细菌抑制其本身囊泡与宿主细胞中的膜结合隔室（如溶酶体）融合的能力。分枝杆菌亦可寄居于缺少腺苷三磷酸酶（ATP酶）且未酸性化的囊泡内。慢性感染单核细胞的呈递抗原能力较弱的事实提示，BCG所寄居的囊泡事实上是存在于正常细胞内的囊泡间通道以外的。如果凋亡时细胞内微环境失调，则不难解释寄居的分枝杆菌何故突然被杀灭的原因。例如，在凋亡时常可发现含有BCG的囊泡与含有毒素的宿主囊泡（如溶酶体）间的融合，或者发现有囊泡的酸性化。此外，宿主细胞的凋亡常伴有核染色质的断裂。死亡细胞基因物质的完整性也受到损坏。凋亡广泛发生于结节之内，而且CTL可通过对其靶细胞的程序性细胞死亡而杀灭这些细胞。CD4＋CTL占致敏个体中的分枝杆菌反应性细胞毒细胞的大部分。所以它能通过诱发凋亡而杀灭多数的靶细胞。

四、总结与结论

结核分枝杆菌侵入人体后可产生一系列的体内反应和细胞免疫应答，使体内的感染得以控制。在宿主的原发感染部位，结核分枝杆菌可在可容纳性的肺泡巨噬细胞中繁殖。然后有感染性的细菌被转入引流淋巴结，在此处分枝杆菌反应性T细胞活化和扩增。活化的T细胞可产生细胞因子，包括IL－2和IFN－γ，此外尚可表现LAK细胞活性。然后，淋巴样LAK细胞和CD4＋T细胞通过感染细胞对细胞内细菌起反应所产生趋化因子的作用而移动至感染部位。开始时只有为数不多的细菌所感染的巨噬细胞随着反应逐渐成熟而大量被感染，但却未能为T细胞所识别。LAK细胞则能识别和裂解慢性感染的单核细胞，并可释放出活菌，这些活菌又再次为周围的巨噬细胞所吞噬。这时分泌的CD4＋T细胞可以被由再次吞噬细胞所提呈的分枝杆菌抗原活化。它们在局部产生肉芽肿形成的信号，引起脉管系统中淋巴样和髓样细胞的移动和流入。肉芽肿结构中含有细菌，但却建立了一个分离的环境，用以隔离和浓缩毒素因子。在此环境内，细胞毒CD4＋T细胞诱导新近感染巨噬细胞的凋亡，开始杀灭细菌，最后控制感染。在这种特殊的成熟结节微环境内，另外还有一些除外CD4＋CT L存在的额外因素有利于凋亡的发生和细菌的抑制。在此情况下，CD4＋T细胞表现有两项重要作用：①它们是诱导凋亡和杀灭细菌的效应细胞；②它们是与结核病的抵抗力密切相关的结节这一特殊微环境的建造者。

（余传霖）

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