第十三章 结核病中的体液免疫应答
研究者曾经在以往的数个世纪内对结核分枝杆菌感染中的体液免疫应答进行了广泛的研究，其目的在于寻求特异且敏感的结核病血清诊断方法。此种情况较为复杂，因为分枝杆菌细胞壁系由许多蛋白质、糖类和类脂所组成，这些物质既可独立存在，也可与脂多糖、糖脂、肽糖脂、糖蛋白等密切结合。这样就存在无数可以与免疫系统发生反应的抗原和表位。首先用以研究的抗原为未经纯化或粗略纯化的抗原制剂，如结核分枝杆菌菌液、结核菌素、纯化蛋白衍化物（PPD）、多糖提取物、生长于各种细菌培养基中的培养物滤液的三氯醋酸沉淀蛋白以及浓缩的培养滤液。用以检测针对这些抗原抗体的免疫学方法有：细菌悬液凝集试验、用各类抗原（蛋白质、多糖、糖脂）致敏的红细胞凝集试验、补体结合试验、抗体包被的惰性颗粒凝集试验、放射免疫检定法、凝胶扩散法等。
一、结核分枝杆菌的特异性抗原
Grange等报告，大多数活动期结核病人都可发现有针对各类结核分枝杆菌抗原的抗体存在，但是也有一部分患有其他疾病的病人和健康人体内也可发现有分枝杆菌的抗体。他们同时对患病和健康个体进行研究，旨在阐明分枝杆菌抗原的特点，用以解释抗体反应间的交叉反应。分枝杆菌和非分枝杆菌可溶性抗原的免疫扩散法分析结果表明分枝杆菌的抗原有几种不同的类型：即存在于所有的分枝杆菌及几种非分枝杆菌中者、仅限在缓慢生长的分枝杆菌中存在者、仅限在快速生长的分枝杆菌中存在者，以及仅限在个别分枝杆菌菌种中存在者。其中有些仅限于菌种中的某些亚组或亚型。鉴于免疫系统可以识别特异的以及共有的抗原，未感染和已被感染但未发病的个体都可对环境内细菌以及共栖细菌发生反应，所以体液免疫应答之间的重叠是不可避免的。
因此，以后的研究的重点即转向获取结核分枝杆菌的特异性抗原，并对这些抗原在诱发患病个体体液免疫应答中的作用进行评估。因为结核分枝杆菌感染在感染个体的一生中可以表现为隐性感染，在这些个体中只有一小部分在原发性感染后发展成为活动性疾病。另外又因为世界上已有数百万人接受了极为相关细菌卡介苗（BCG）的免疫，故研究即将致力于与活动性疾病有关抗原的鉴定。
在此目标下进行了一系列的研究，其中之一为用加热灭活、超声处理或射线杀灭的分枝杆菌免疫小鼠，然后在体外制备成相应的单克隆抗体，从而获得对个别抗原或表位特异的抗体制剂。通过筛选由分枝杆菌DN A的重组DN A表达文库，即可利用这些抗体获得纯化形式的相应抗原，并可用其进行分枝杆菌裂解物亲和纯化个别的抗原。第一套小鼠单克隆抗体都是在BA LB/c小鼠中制备的。并可识别分子量为71×103，65×103，38×103，23×103，19×103，14×103和12×103蛋白质。因为不同实验室中所获得的这7种抗原均相同，故可认为这些抗原是结核分枝杆菌的免疫优势抗原。以后的研究证实，分子量71×103，65×103和12×103抗原即与大肠埃希菌DnaK，GroEL，GroES有广泛同源性的热休克蛋白。23×103抗原为超氧化物歧化酶，在其他分枝杆菌和大肠埃希菌内亦有其存在。38×103抗原与大肠埃希菌的Pho－S蛋白有明显的同源性。分子量14×103蛋白也是一种低分子量的热休克蛋白。这些抗原虽都不是结核分枝杆菌的特异性抗原，但有些小鼠的单克隆抗体能识别结核分枝杆菌所特有的表位，并且因而鉴定出分子量85×103，38×103，19×103和14×103抗原上的特异性表位。以后有人用其他品系小鼠制备单克隆抗体，识别了另外几种抗原，其分子量分别为85×103，58×103，33×103，28×103，24×103，19×103和10×103，并且获得能识别在分子量85×103，58×103和24×103蛋白质上的结核分枝杆菌特异性表位的单克隆抗体。
另外有的研究者用各种生物化学方法来纯化结核分枝杆菌的重要抗原。如Daniel等由结核分枝杆菌的无细胞的培养滤液中获得一种半纯化抗原，称为抗原5。这种抗原是一种分子量大小为35×103的糖蛋白。以后应用小鼠单克隆抗体的研究表明它是与分子量38×103蛋白相同的蛋白质。Lee等纯化结核分枝杆菌的主要膜蛋白，这种蛋白质与首先用小鼠单克隆抗体所鉴定的分子量14×103抗原相同。也可用生物化学方法纯化结核分枝杆菌的非蛋白性质的抗原，包括脂阿拉伯糖甘露糖聚糖（LAM）、酚糖脂和磺基脂抗原。
正在主动生长的分枝杆菌可逐步释放数种抗原至培养上清液之中。Andersen等鉴定出33种这样的蛋白质，其中分子量23×103的超氧化物歧化酶首先出现，然后继之以分子量（70～72）×103，82×103蛋白质等等。在这些蛋白质中，分子量（30～31）×103蛋白质已证实为几种分枝杆菌的主要分泌性抗原。这些蛋白质可以与纤连蛋白结合，纤连蛋白是参与细菌和真核细胞表面相互作用的一种糖蛋白。分枝杆菌所产生的这类蛋白质亦称抗原85复合体，至少包含有3种密切相关的蛋白质，即85A，85B和85C。它们已证实是用以评估结核病人体液免疫应答的许多不同抗原制剂的组分。例如，抗原85A，P32和MPB44/MPT44相当于相同的分子量31×103纤连蛋白结合蛋白质。Daniel和Janicki的抗原6制剂相当于为分离的纤连蛋白结合蛋白质。在牛型分枝杆菌BCG的培养上清液中尚可获得抗原85B（亦称α抗原，MPB59/NPT59和分子量30×103抗原）。除了上述的抗原以外，目前应用生物化学、免疫学或重组方法尚可获得40多种其他蛋白质。
二、结核分枝杆菌抗原的体液免疫应答
（一）结核分枝杆菌抗原的抗体应答
曾对结核分枝杆菌的一些抗原进行研究，如在病人、接触者和健康人体内都发现有抗分子量38×103抗原的抗体存在。Daniel等用半纯化的抗原5以直接酶联免疫吸附检定法（ELISA）检测血清中的针对分子量38×103的抗体。Jackett等及Bothamley等则用基于小鼠单克隆抗体的免疫亲和纯化法获得分子量38×103抗原。这两项研究均报告85%的痰涂片抗酸菌阳性的晚期结核病人血清中均有针对分子量38×103抗原的抗体，而对照血清则无一为阳性。仅有15%的涂片阴性的结核病人产生分子量38×103抗原的抗体。也检定了用单克隆抗体TB71和TB72所确定的分子量38×103抗原上特异表位的抗体滴度，而且分别有56%和73%的晚期结核病人有针对这些表位的抗体。只有11%和18%的涂片阴性个体产生由TB71和TB72所确定抗原的抗体。这些结果表明，在人类细菌含量高的晚期结核病人中，可以有针对分子量38×103抗原的抗体产生。这与感染了活菌的小鼠抗体应答有所不同。在这些小鼠中，针对分子量38×103抗原的抗体首先出现，故与感染的早期过程有关。也可用直接ELISA法检测以基于单克隆抗体亲和层析法纯化的分子量65×103，19×103和14×103抗原的抗体应答。大部分的涂片阳性结核病人有这些抗原的抗体（72%有抗分子量14×103抗体，61%有抗分子量19×103抗体，11%有抗分子量65×103抗体）；58%和46%的涂片阴性结核病人分别产生针对分子量14×103和19×103抗原的抗体；仅4%～14%的涂片阴性者有小鼠单克隆抗体确定的这两种抗原上特异性表位的抗体，而在晚期结核病人中则有46%～73%的阳性率。这些结果表明，在结核病早期为人类所识别的分子量14×103和19×103抗原上的表位，有别于小鼠以结核分枝杆菌制剂免疫后所识别者。用有毒结核分枝杆菌H37Rv菌株抗原免疫的家兔也不能产生针对分子量19×103抗原的抗体。以小鼠单克隆抗体鉴定的分子量71×103蛋白与大肠埃希菌和人类中的同源物有50%的同源性。近期用重叠肽所作的研究表明，在此蛋白质的种特异性C－末端序列上最少可鉴定出4种表位，而且涂片阴性的早期结核病人血清中可有针对这些表位中某一表位的抗体。
在所分泌的抗原中，研究较为深入者为纤连蛋白结合蛋白的体液免疫应答。在结核和非结核病人血清中都可发现有85A抗原的抗体，但是只有结核病人才有抗85B抗体。这些抗原在以活的结核分枝杆菌感染小鼠的早期，可能并不是免疫优势抗原。约有2/3的涂片阳性的晚期结核病人能产生针对分子量38×103抗原的抗体。针对非蛋白性L A M的抗体曾在结核病人中发现，而不能在健康对照者中发现。组织胞浆菌病和副球孢子菌病病人血清中则有抗L A M抗体，提示真菌也有类似L A M的抗原。此外，L A M存在于所有的分枝杆菌中，故不能用以区分结核和非结核分枝杆菌感染。在晚期结核病病人血清内尚可发现有抗酚糖脂和磺基脂抗体。
（二）抗体应答的直接分析
用十二烷基硫酸钠（SDS）－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分级分离裂解结核分枝杆菌细胞或其生长的培养物上清液，将所分离分子量为（10～100）×103以上的蛋白质电泳转移至硝酸纤维素膜上，然后再与病人血清进行试验。这一技术可为特定血清标本中可被抗体识别的各种抗原的整个抗原分布型提供有意义的信息。但进行SDS－PAGE的样品须经与SDS和β－巯基乙醇的煮沸，如此将引起抗原的变性和构象表位的破坏。Espitia等由结核分枝杆菌H37Rv培养上清液中分级分离硫酸铵沉淀的蛋白质，发现抗原分级分离成35个条带。不同的结核病人的血清识别不同抗原，但并无确定的分布型。可为所有结核病人血清所能识别的抗原总共有25种。由非结核个体获取的对照血清则总共有14种抗原的抗体。但90%的对照血清只与一种或多种结核分枝杆菌抗原发生反应。只有一种抗原，即与用小鼠单克隆抗体鉴定的分子量38×103蛋白相同的分子量38×103蛋白，不为任何对照血清所识别，而50%的结核病人血清中存有这一蛋白质的抗体。Espitia等发现，分子量（30～31）×103抗原可为90%的结核病人血清和56%的对照血清识别。
Havlir等对结核和非结核病人血清所识别的结核分枝杆菌的抗原进行了相似的抗原分布型分析。结果发现，虽然结核病人血清中含有较高滴度的抗体，但在Western印迹分析中结核病人和正常人都可与许多组分发生反应，不可能鉴别结核病人血清中的任何特异性抗体。Coates等用超声波处理的细菌悬液作为抗原来源，发现结核和对照血清中都有许多抗原的抗体，对其中所识别的抗原较为明现者为分子量14×103，30×103，38×103，45×103和65×103抗原。分子量10×103抗原则不被对照血清所识别，但只有10%的结核病人血清中含有此种抗原的抗体。
Verbon等用SDS－PAGE和凝胶渗透层析（GPC）分级分离培养上清液中的抗原，并用前者进行Western印迹分析；后者所获取的组分用于ELISA检定，用以检测结核病人和正常人血清中抗体的反应性。他们发现，虽然用Western印迹分析中的两类都含有针对分子量65×103，61×103，58×103，30×103和24×103的抗体，25份结核病人血清中有16份血清在ELISA检定中显示了与分子量24×103抗原间的反应，但对照血清则无反应。由此可见，用ELISA所显示的表位与在Western印迹法中所见者是不同的。此外，在ELISA中26份血清有14份血清与分子量12×103抗原发生反应。结合分子量24×103和12×103抗原的结果，26份血清中的20份血清中有对一种或两种这些抗原的抗体。而所有21份对照血清则无针对这些抗原的抗体。在所有的直接分析中，也有一小部分病人不能识别任何结核分枝杆菌的抗原。
由动物或人类免疫系统所识别的结核分枝杆菌抗原上的表位是有所不同的，此种情况亦可见于另一分枝杆菌感染——麻风。利用已知麻风病人的血清，可鉴定出麻风分枝杆菌不能为小鼠或家兔免疫血清检出的优势抗原。近来Wallis等用双向凝胶扩散分级分离含有结核分枝杆菌分泌抗原的培养上清液，发现着一组分内含有150余种蛋白质。由于单向凝胶扩散只能将培养上请液分离成30～40个条带，故每一条带代表几种不同的抗原。此外，许多已知的结核分枝杆菌抗原上既有特异性的，也有交叉性质的表位。这种情况在一些未确定的抗原中也是如此。正常人和结核病人的血清中都有针对可引起结核分枝杆菌和其他环境及共栖菌交叉反应的表位的抗体存在；而且后者尚有针对特异性抗原或表位的抗体。抗原的变性将破坏抗原上的构象表位，导致与抗体的反应性消失或降低。用ELISA检测时，80%～85%的结核病人有针对分子量38×103抗原的抗体，但用Western印迹法检侧，则仅有50%的病人具有此种抗体。结核分枝杆菌可以产生数百种抗原，每一抗原上又有几个表位可供免疫系统识别，人的免疫系统因而可通过产生抗体与许多分枝杆菌抗原发生反应。目前主要的挑战应为设计研究人类体液免疫应答的策略，从而确定只有在患有活动疾病的个体中可被识别的结核分枝杆菌种特异性抗原或表位。
三、人类免疫缺陷病毒感染个体中针对结核分枝杆菌的体液免疫应答
获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）病人外周血中B细胞的百分率正常，其针对几种感染病原体（巨细胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、溶组织内阿米巴、烟曲霉、白色念珠菌）的抗体水平亦正常或有所上升，表明艾滋病病人对抗原产生体液免疫应答的能力并未普遍下降。人类免疫缺陷病毒（HIV）感染病人中结核病的诊断较为复杂，这是因为这些病人的放射学检查结果不典型；由于病人细胞免疫降低，纯化蛋白衍化物（PPD）皮肤反应常为阴性。此外，结核分枝杆菌在缺少细胞免疫的情况下大量生长，往往在未获培养细菌的实验室确诊以前病人即告死亡。
有些研究对HIV感染病人的抗结核分枝杆菌抗体进行评估，以确定其在协助诊断结核病的应用价值。Van Vooren等报告，在HIV感染病人痰中出现分枝杆菌以前，针对整个培养滤液中抗原和纯化抗原P32（与85 A抗原相同）的抗体水平上升。但这两种抗原的抗体滴度较之以往在非艾滋病结核病人中所测定的阳性率上限为低。Farber等人对8例HIV感染的结核病人评估对这些抗原的抗体滴度，发现有7例抗体滴度升高。但Mc Donough等在36例同时有HIV和结核感染的病人中并未发现有85B抗原的抗体。
Barrera等用直接ELISA检测HIV感染病人血清中结核分枝杆菌PPD抗体应答，用以评估对结核分枝杆菌的体液免疫应答。在20例患有结核的艾滋病人中并未发现有抗体，而在22例患有结核的HIV血清阳性个体中有8例发现有抗体存在。因为此时未对反应个体和非反应个体的T细胞的分布形式进行检测，故难以确定抗体的存在是否与T淋巴细胞的协助相关。
有两个实验室中的研究报告在HIV感染的结核病人血清中存有针对一抗原制剂的抗体。此种抗原称为A60，是一种含有约30种组分的复杂混合物，其中包括分子量65×103，40×103，38×103，35×103，19×103和14×103蛋白，L A M和一种糖脂。Van der Werf等用牛型分枝杆菌的A60抗原以ELISA法检测HIV感染的结核病人、HIV感染的非结核病人、非HIV感染的结核病人及非HIV感染的非结核对照者对这一抗原的抗体滴度。结果发现在两个HIV感染组中均无抗A60抗体；而近80%的非HIV感染的结核病人有此种抗体。Saltini等用Western印迹法分析A60抗原的各个蛋白组分，并用SDS－PAGE分级分离A60蛋白，转移至硝基纤维膜上。然后与各类血清发生反应。他们报告，PPD皮肤试验阴性和阳性个体的血清都有针对分子量65×103和59×103热休克蛋白的抗体；但皮肤试验阳性者血清中还可发现有针对结核分枝杆菌的分子量38×103，28×103或19×103抗原中的最少两个抗原的抗体。另有人报告，BCG免疫个体血清中缺少抗分子量38×103抗原的抗体和抗分子量19×103抗原的抗体。Saltini等又报告，HIV血清阳性、PPD皮肤试验阳性个体其CD4＋T细胞数在400/mm3以上者都有针对分子量38×103，28×103和19×103抗原的抗体；而CD4＋T细胞数在200/mm3以下者只有42%含有这些抗原的抗体。有些PPD皮肤试验阴性、HIV血清阳性个体含有针对分子量45×103，38×103，28×103或24×103蛋白的抗体，这些抗原均不能为非HIV感染、PPD阴性个体所识别。患有结核的HIV感染病人则含有抗分子量65×103和50×103抗原的抗体，这两种抗原是可为所有血清识别的热休克蛋白，但无一含有抗分子量38×103，28×103和19×103抗原的抗体。至于为什么在患有结核的HIV感染病人中对交叉反应性抗原的抗体持续存在，而相对特异的应答消失个原因，目前尚不清楚。
Martin－Casabona等用磺基脂IV抗原以E LISA检测19例H IV感染的结核病人血清中的抗体。结果发现，19人中有18人的血清中含有针对结核分枝杆菌磺基脂IV抗原的抗体，而PPD皮肤试验阳性或阴性的健康人对照则缺少此种抗原的抗体。Laal等用结核分枝杆菌的L A M、细胞壁、细胞壁相关蛋白质和培养滤液中的分泌蛋白作为抗原，以评估HIV感染的结核病人的抗体应答。初步资料表明。如不考虑CD4＋T细胞数目，60%的HIV感染的结核病人血清内有抗分泌性分枝杆菌抗原的抗体。此外在有些病人中也有抗LAM和细胞壁蛋白质的抗体。
（余传霖）
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