结核分枝杆菌感染的发病机制

第十九章　结核分枝杆菌感染的发病机制

结核分枝杆菌在演化过程中获得与人体共同生存的能力。在20世纪中，人类已发展了有利于其本身方面的有效措施，例如社会经济条件、适当的居室条件和营养的改善，疾病发生后的有效诊断和治疗等。但是斗争绝非仅限于某一方面。结核菌仍力图减弱人体的防御能力。其他疾病，如人类免疫缺陷病毒（HIV）、感染流行上的变化将使平衡趋向于有利于细菌这一方面；而耐药性的逐渐发展又可进一步降低宿主的防御力。对于这一复杂相互作用有关机制的了解，已经成为今日结核病研究中的主要挑战。

一、细菌进入细胞的方式

结核分枝杆菌是一种兼性细胞内寄生的病原体，能有效地在活化的巨噬细胞内生存，几乎所有的结核感染均系通过呼吸道途径吸入了含菌的显微镜下大小气溶化微粒核心（5～10μm）而引起，即由于咳嗽、喷嚏或与有高度感染性的带菌者讲话而播散，只有那些小至不为支气管黏膜纤毛所捕取而由空气传入的微粒，方可到达肺泡。因此。所有的微粒中，约有10%到达肺泡。小至能够到达肺泡的微粒中所含有的细菌一般不超过3个。感染多发生于所谓原发性感染部位，在此有较多的气流便于吸入细菌沉集。这些部位包括肺的上叶、中叶和肺尖的前部以及下叶的下部。细菌进入肺泡后即为肺泡巨噬细胞所吞噬。吸入的细菌是否能引起感染取决于细菌的毒力与吞噬了细菌的肺泡巨噬细胞的固有杀菌能力。结核分枝杆菌是通过与几种不同的细胞表面分子的结合而进入巨噬细胞的。细菌进入细胞的确切方式可以决定其在巨噬细胞中的命运。结核分枝杆菌在进入细胞以前可与4种以上不同的细胞表面受体结合。所有的补体受体都在结核分枝杆菌与巨噬细胞的结合上起作用。这些受体的抗体都能有效地抑制细菌对巨噬细胞的黏附和被其吞入。体外研究表明有许多涉及分枝杆菌进入巨噬细胞的机制，包括通过补体替代活化途径的C3对分枝杆菌的调理作用，后继之以通过补体受体CR1，CR3和CR4的进入宿主巨噬细胞。Schorey等证实人的补体裂解产物C2a可为结核分枝杆菌用以产生能促进进入巨噬细胞的调理素。

巨噬细胞可通过纤连蛋白黏附至分枝杆菌。巨噬细胞上的甘露糖受体亦可通过非调理素介导的方式识别分枝杆菌表面的末端甘露糖残基而参与结合与吞噬作用。这些残基中研究较多者为脂阿拉伯糖甘露糖聚糖（LAM）。LAM是分枝杆菌的主要抗原性脂聚糖，由高度分枝的甘露糖和阿拉伯糖多聚物所组成，并连接至菌膜中的一寡甘露糖核心聚糖上。有毒力的分枝杆菌LAM有一附加的甘露糖残基加帽（man－LAM），有别于快速生长的非致病性分枝杆菌（ara－LAM）的生长。这种加帽作用（capping）的有无能影响巨噬细胞应答和细菌与巨噬细胞甘露糖受体的结合。在宿主肺防御功能上起作用的肺表面活性剂中的主要蛋白质SP－A，已证实与结核分枝杆菌通过甘露糖受体以及特异性SP－A受体与巨噬细胞的结合有关。此外并证实革兰阴性菌脂多糖信号传递受体CD14也与摄取未经调理的结核分枝杆菌有关。但是这种摄取是否由CD14的已知受体L A M所介导则尚不清楚。

一般认为，巨噬细胞的吞噬作用对于结核分枝杆菌的生存和疾病的启动是必需的，不过细菌侵入非吞噬细胞，如呼吸道上皮细胞，对于病原菌的生存也是有利的。近期已克隆出一种能使非吞噬性的大肠埃希菌侵入上皮细胞和非上皮细胞，并可在这些细胞中生存的结核分枝杆菌DN A片段。已发现结合肝素的血凝素黏附蛋白（HB H A）决定对2型肺细胞的侵入，并可因而决定结核分枝杆菌的肺外扩散。因此，缺少hbha基因的细菌虽在正常情况下定居于肺脏，但却不能在脾脏中定居。

二、结核分枝杆菌在细胞中的命运

结核分枝杆菌在其所感染的多数人群中引起慢性无症状的感染。全世界人群中有1/3受到结核病的感染，但是只有10%发生活动性结核。可见宿主的免疫应答能有效地控制分枝杆菌在其余人群中的复制。结核分枝杆菌可通过其能在巨噬细胞中无限期生存而维持这种慢性感染。这种情况部分上是由于致病性分枝杆菌即使在面对有效的T细胞免疫应答时仍具有能在敌对的巨噬细胞环境条件下生存的能力。其结果是，有一小部分活的和潜伏的分枝杆菌可以在肺部感染部位或网状内皮系统中持续存在。细菌可在数年的潜伏后又重新开始复制，导致临床疾病的再次活化。分枝杆菌能在巨噬细胞中生存和复制的机制有多种。当结核菌内在化于巨噬细胞以后，就必须要能抵抗细胞内任何固有的杀菌活性，使其能在此环境内生存和引起持续性的感染。对于分枝杆菌能与巨噬细胞相互作用和使其能对抗宿主正常防御的分子机制进行研究，在深入了解疾病的发病机制上是至关重要的。

结核分枝杆菌破坏宿主巨噬细胞抗菌功能的机制可阻止溶酶体与已被感染吞噬体的融合，从而防止吞噬体中的酸化。一般被吞噬的物质是内在化于巨噬细胞胞质中以后在溶酶体中被消化，这样就构成有效的吞噬抗菌防御活性。在结核分枝杆菌的情况下则与之有所不同，活菌被吞噬后却是与溶酶体分开的，但死菌则并非如此。这样就使活菌能逃避与吞噬作用有关的抗菌活性的作用，而表现其细胞内命运，提示细菌的生活力是抑制融合的因素。这样可部分解释结核分枝杆菌持续存在于宿主细胞和其不被免疫识别的原因。结核分枝杆菌尚可因抑制磷酸肌醇3－磷酸和Rab5效应早期内质体自身抗原（EEA1）而防止巨噬细胞吞噬体的成熟。也有可能，有毒结核分枝杆菌也可离开吞噬空泡而进入巨噬细胞的胞质，从而免于死亡。但是这一机制对细菌的生存上并不重要，而是有利于分枝杆菌组成进行M HC－Ⅰ类途径的抗原呈递过程。

此外，关键性分枝杆菌蛋白质的表达也可增强细菌适应敌对的巨噬细胞环境的能力。例如，诱生热休克蛋白（Hsp），如Hsp－60和Hsp－70，可以因其分子伴侣蛋白（chaperone）功能而有利于分枝杆菌蛋白质的再折叠装配和膜转运，而细菌分泌的超氧化物歧化酶则可通过麻痹活化巨噬细胞生成的毒性超氧化物基团而限制氧化应激反应的毒性效应。一种与细胞壁相关的主要复杂脂多糖L A M，是细菌在巨噬细胞内大量产生者，它在对抗巨噬细胞的抗菌机制上表现许多关键性功能，也是人和小鼠巨噬细胞产生T NFα的有效诱生物。T NFα是宿主针对分枝杆菌早期应答中的重要组分，并与T细胞产生的IFN－γ协同作用以刺激杀菌机制。然而来源于有毒菌株（man－LAM）和无毒菌株（ara－LAM）者在LAM的活性上有重要的差异。有毒结核分枝杆菌的man－LAM在诱生巨噬细胞产生TNFα的能力上远不及无毒分枝杆菌的ara－LAM。此外。man－LAM也不能活化与巨噬细胞早期活化有关的重要基因。

LAM还可使巨噬细胞的另一重要抗菌机制——呼吸暴发成为无效，这是LAM通过作用于对反应性氧基和抑制吞噬细胞中氧化暴发的活化起重要作用的酶类所致。LAM的这种作用使细菌进一步能在感染的巨噬细胞中增殖，因而LAM就成为分枝杆菌毒力的一种重要的决定因子。结核分枝杆菌尚可抵抗氧化暴发的抗菌作用，特别是能特异地抵抗反应性氧中间产物（ROI）。但是至今尚无分枝杆菌能抵抗其他氧依赖性抗菌机制的报道，如反应性氮中间产物（RNI）暴发，不过也发现有RNI抵抗性的菌株存在，而且在动物模型和人类中都是毒力较大者。目前已在致病性的结核分枝杆菌临床分离物中克隆出一新型基因，不论细菌在培养基中接触了外界化合物或巨噬细胞中的内源性产物时，这种基因在非致病性分枝杆菌中的表达都可增强细菌抵抗RNI和ROI的能力。

另有些事实表明，TGFβ（尤为TGFβ1同工型）和IL－10是来源于巨噬细胞的、决定宿主对分枝杆菌感染免疫应答降低的主要细胞因子。TGFβ是目前已知最强的一种内源性免疫抑制因子。结核分枝杆菌能诱发TGFβ和IL－10这些具有免抑制活性细胞因子的产生，以有利于其生存。这是因为它们能诱导TGFβ1mRNA的表达以及为其感染细胞中活性蛋白质的分泌，并可引起单核吞噬细胞中IL－10的表达，借以下调特异性共同刺激分子。在此情况下，结核分枝杆菌能对与决定抗分枝杆菌感染的保护性免疫有关的许多重要机制产生抑制作用。重要的是，TGFβ可以干扰重要的巨噬细胞杀菌机制，如小鼠中氮中间代谢产物和豚鼠及人类中反应性氧中间代谢产物的生成。因为近年来已证实RNI在限制小鼠或肺泡巨噬细胞中结核分枝杆菌生长的作用，TGFβ可能增强这些细胞中分枝杆菌的复制。这两种细胞因子都对促炎细胞因子的产生有较强的抑制效应，降低IL－1，IL－6，IL－12和IFN－γ的产生，所有的这些细胞因子都是重要的抗分枝杆菌效应分子。

已有许多事实表明，结核分枝杆菌能长期潜伏于宿主组织内，但对潜伏结核分枝杆菌的生理状态所知不多。近年研究证实潜伏分枝杆菌在厌氧生活时期可切断蛋白质的合成，但对恢复蛋白质产生的一些刺激仍可发生反应。

三、结核病中的细胞免疫应答

（一）巨噬细胞的作用

1.作为杀菌细胞　最终破坏结核分枝杆菌的效应细胞是活化的巨噬细胞。但是人类单核巨噬细胞杀灭或抑制结核分枝杆菌生长的机制还不太清楚。氧依赖性和非依赖性机制都是活化巨噬细胞抗分枝杆菌功能的重要武器。氧依赖系统包括ROI（由巨噬细胞氧化性暴发介导）和RNI的产生。RNI是通过诱导性NO合酶（NOS2）的作用而使氨基酸L－精氨酸氧化，产生NO的高输出途径中形成的。NO合成的重要性已在啮齿动物巨噬细胞中得到充分的证明，认为它是分枝杆菌感染中专职巨噬细胞抗菌活性的一种关键性成分。近年来证明活动期结核病人的支气管肺泡抽取液标本的研究结果证明，NOS2至少也是人体内巨噬细胞的抗分枝杆菌活性表现的一部分。

巨噬细胞的非氧依赖性杀菌机制包括巨噬溶酶体中的酸化、溶酶体酶类的活化、抗菌分子（如防御素）的产生以及营养消除。单核巨噬细胞能合成和分泌许多炎症介质，它们在肉芽肿形成、增强炎症和杀灭分枝杆菌上都起重要作用，并对其他效应细胞表现强的趋化吸引作用，结核分枝杆菌能刺激许多巨噬细胞的关键性细胞因子和趋化因子的基因表达和产生加强，从而通过复杂的相互作用而增强此种细胞的效应和辅佐功能。“早期反应”细胞因子肿瘤坏死因子－α（T NFα）在结核感染中的免疫保护作用已在小鼠模型和分枝杆菌疾病的体外模型中得到明确的证实，即可由于天然免疫系统早期限制细菌的生长。不过在人类中T NFα也可表现一定程度的结核病所特有的组织损伤性免疫病理作用。在感染部位有T NFα及其受体的释放，而且已证实T NFα是决定人类结核病熟知症状和体征（如体重下降、夜间盗汗和组织坏死等）的细胞因子之一。T N Fα活性的中和可导致临床上的改善。Moreira等在一小鼠的结核模型中发现，选择性部分使用T N Fα抑制物肽胺哌啶酮（thalidomide）的免疫调节能降低炎症细胞因子的含量，并可同时减轻肺部的病理变化。

近年证实，来源于巨噬细胞的IL－12在对抗包括结核分枝杆菌在内的细胞内寄生病原菌的宿主防御机制上起决定性的作用。它是作为对抗分枝杆菌感染而首先出现的宿主应答之一，可以和T N F一起共用诱导自然杀伤细胞（N K细胞）产生IFN－γ，便于1型辅助性T细胞（Th1）应答的形成，并增强其细胞毒活性。这些机制在对抗结核保护性免疫的诱生上至关重要。同时也是对抗分枝杆菌早期天然免疫的决定性因素。近期在分枝杆菌疾病的小鼠模型中证实，遗传易感的小鼠感染了分枝杆菌以后，IL－12和其他诱导IFN－γ细胞因子的表达下降。

早期细胞因子的产生对于天然免疫应答的发生，使之在细胞免疫发生以前就可快速控制感染，并可通过促进T细胞和巨噬细胞功能的表达而对获得性细胞免疫应答表现其诱导作用。趋化因子有可能在对结核的宿主免疫应答的早期起重要作用，特别是在动员单核细胞和淋巴细胞群体，向感染部位移动，以及启动肉芽肿的形成时。在人类和小鼠的研究中已证实了当结核分枝杆菌被吞噬后即可诱生许多不同的趋化因子。例如，C－C趋化因子受体2的缺失可使小鼠的存活降低，而且这种情况与巨噬细胞、树突状细胞和T细胞移动至肺部能力上的缺陷有关。很有可能在人类结核中，促炎细胞因子及趋化因子成为在动员和活化细胞免疫应答中起重要作用的许多介质的一部分，它们在肉芽肿形成和决定最后导致疾病发展或消退的免疫应答类型中起作用。除了细胞因子以外，维生素D3也可增强巨噬细胞杀灭细菌的能力，而且受到磷酸酰肌醇－3激酶和N APD H－依赖性氧化酶的调节。

2.作为抗原呈递细胞　巨噬细胞是结核分枝杆菌免疫应答中呈递抗原至各种淋巴细胞亚群的一种重要的抗原呈递细胞。分枝杆菌抗原与主要组织相容性Ⅰ类或Ⅱ类分子一起为CD4或CD8－αβT细胞受体（TCR）阳性的T细胞所识别。近年来已证明巨噬细胞可以与非多态性类似M HC的表面分子CD1b一起共同呈递非肽性质的分枝杆菌抗原，如L A M。这种呈递作用是通过一种特殊的淋巴细胞——CD4－CD8－αβ^－T细胞完成的，这样就构成了另外的一种防御机制，也可能是早期天然免疫应答的一部分。

近期鉴定的小鼠编码天然抵抗力相关巨噬细胞蛋白－1（Nramp－1）的基因，使人们对巨噬细胞如何被调节以及在细胞内感染中抗原的处理和提呈如何受到影响有了进一步的了解。这种只表达于网状内皮细胞的基因表现细胞水平上的多范围多效效应，包括许多早期应答细胞因子的调节、NO的释放、MHC－Ⅱ类分子和氧化呼吸暴发的上调等。实验研究结果明确提示Nramp－1表型是由巨噬细胞介导的。Nramp是表达于巨噬细胞的溶酶体部分的一种完整的膜蛋白，而且在吞噬作用发生不久后即转移至吞噬体，它可通过转运吞噬体抗菌功能所必需的金属离子而增强对许多在抗原性上无关的细胞内寄生物的杀灭能力，包括结核分枝杆菌。带有Nramp－1感染易感突变株等位基因的小鼠不能控制细胞内的感染。这种基因的人类中的同源物称为Nramp－1，也是人类结核病中的一种强作用的候选基因，曾经克隆化和作图于人的35对染色体。Nramp－1的基因变异能影响对西非人群的涂片阳性结核病的易感性。但对南美人群则无影响。

（二）结核病中的T细胞

结核病是一种需要有T细胞来加以控制的原型感染。T细胞与巨噬细胞间的协同作用在获得抗分枝杆菌的保护性免疫上至关重要，而且与促炎细胞因子的环境有关。这是一种极为复杂的过程，涉及许多T细胞亚群，表现多种功能，包括迟发型超敏反应、细胞裂解、保护性和记忆性免疫的诱导等。多数接触了结核病的病人在开始的10周内发生原发感染。此时出现强烈的迟发型超敏反应；表明有获得性细胞免疫应答产生，这种反应一般认为是T细胞与巨噬细胞协同作用的结果，因为只有少数（5%～10%）新近感染者发展成为原发性疾病或在潜伏期后再次活化。

1.CD4＋T细胞　决定抗结核免疫应答调节的原发性T细胞亚群为CD4＋T细胞。抗分枝杆菌的细胞介导应答是通过CD4＋T细胞释放特异的细胞因子来完成的。在小鼠模型中有两种不同的CD4＋T细胞群体，它们可根据其所分泌的细胞因子来区分。Th1型T细胞通过分泌IFN－γ和IL－2介导迟发型变态反应；而Th2型T细胞则是通过分泌IL－4，IL－5和IL－10增强抗体产生。在小鼠模型中应用基因剔除技术或中和抗体的实验均证实，对结核分枝杆菌感染的保护力是由Th1型T细胞应答所介导的，此外，IFN－γ的产生也是决定小鼠抗结核分枝杆菌过继免疫的功能性标记。可见对小鼠分枝杆菌感染的免疫抵抗力可能由Th1细胞介导，而Th2型细胞因子在抗分枝杆菌免疫上的可能作用尚未明确。

有些研究者报告，过度的Th2型T细胞应答及其细胞因子的产生常与缺陷性肉芽肿的形成和对结核感染抵抗力下降有关。对某些分枝杆菌感染易感的小鼠产生高水平Th2型的IL－4，而较少有IFN－γ。在另一相同的纯系小鼠中则发现，诱发针对鸟分枝杆菌Th1型应答的细胞因子表达降低。其他的研究工作提示，原属较强的抗结核的极化Th1型应答可被下调而转向Th2型T细胞应答，这可能是由于巨噬细胞产生和释放前列腺素和其他免疫抑制性细胞因子所致。这种Th2转换在肺结核的晚期慢性肺炎期中尤为明显，并可下调增强的Th1型T细胞所致的有害免疫病理后果，也可启动针对死的分枝杆菌的体液免疫应答。Rook和Hernandez－Pando提出，如果Th2型应答加上原已存在的Th1型应答，则所形成的细胞介导的炎症部位就对细胞因子介导的损伤变得极为敏感，从而使局部组织损伤加剧。

在以结核分枝杆菌感染的IL－6缺陷突变株小鼠模型中，可以证实细胞因子IL－6在抗结核保护性中的作用。基因剔除小鼠中的脾细胞能在体外细胞培养中使Th2型细胞因子IL－4水平上升和Th1型细胞因子IFN－γ水平下降，由所有的这些研究结果可知，Th2型细胞因子IL－4在抗分枝杆菌感染的保护性上并无直接作用。目前已有愈来愈多的事实说明人类中的抗分枝杆菌感染的免疫应答同样也是由分泌特异细胞因子程式的T细胞亚群所介导的。人类T细胞也如同上述的小鼠Th1和Th2细胞一样也表现细胞因子分泌的二歧化程式。但是所发表的人类T细胞针对结核分枝杆菌的细胞因子产生的有关资料尚不一致。例如有的体外研究报告健康供血者的分枝杆菌－反应性T细胞克隆可分泌IFN－γ和IL－2，但很少有IL－4和IL－5；而另有人报告多数结核分枝杆菌－反应性T细胞克隆产生Th1和Th2细胞因子。不过较为有意义的研究是对感染部位细胞因子应答的评估。胸膜结核是一种自愈性感染，是研究局部保护性免疫的良好模型。其特点是有抗原特异性、能分泌IF N－γ和细胞毒活性的CD4＋T细胞移动至胸膜部位。

人类结核中Th1应答的下降是否为免抑制性细胞因子，如TGFβ和IL－10的过量产生以及IL－10和IL－12受体表达上的差异所致，而不是由于直接的Th1/Th2平衡失调所致，将是一个十分有意义的问题。这些细胞因子在适当浓度下可下调免疫应答，并且可限制组织损伤的程度。相反，如果这些免疫抑制性细胞因子过量产生，则不能控制感染。

2.CD8＋T细胞　另一与控制结核分枝杆菌感染有关的细胞免疫组分为CD8＋T细胞。这种细胞是另外的一类表达α－βT细胞受体的T细胞，能识别由M H C－Ⅰ类分子所提呈的抗原肽，并与之发生反应。小鼠中通过M HC－Ⅰ类分子表面表达所必需基因的基因突变而有选择性地消除CD8＋T细胞或丧失有功能活性的CD8＋T细胞时，当其感染结核时常很快地死亡。虽CD8＋T细胞的主要作用为细胞毒反应，但是这一功能在抗结核分枝杆菌的保护性上并非必需。因为对小鼠中编码决定细胞毒功能诱导分子的两个基因之一进行定向破坏，并不能使其较之野生型小鼠有对结核更高的易感性。

CD8＋T细胞也可产生一些细胞因子，其中也包括IFN－γ，正是由于这种细胞因子的产生也就决定了CD8＋T细胞的存在在抗结核保护性中是必需的。人类的CD8＋T细胞在分枝杆菌抗原的刺激下或在活动肺结核感染时都可发生增殖，CD8＋细胞在被感染的肺泡处扩增，并且与局部宿主防御和疾病的免疫病理机制有关。另外CD8＋T细胞也可在结核病的组织损伤免疫病理中起作用，因研究表明在具有广泛组织坏死结核病人的外周血中含有大量的细胞毒性T淋巴细胞。BCG免疫接种后，CD8＋T细胞活化，并且在抗结核的保护性免疫中起主动作用。

3.γ－δT细胞　T细胞抗原受体（TCR）提供T淋巴细胞识别各种抗原的能力。有两类不同形式的TCR，由多种α－β或γ－δ异二聚体组成，并与不变性CD3构成复合体。γ－δT细胞是在抗结核细胞免疫应答中起重要作用的第二个主要T淋巴细胞亚群，并占循环血T淋巴细胞的1%～5%。γ－δT细胞能识别非肽类性质的分枝杆菌配体，这种识别并不依赖于巨噬细胞上的M H C分子。其活化依赖于辅佐细胞，这是人的肺泡巨噬细胞所表现的一项功能。只有整个分枝杆菌组成诱发γ－δT细胞的增殖，因为结核分枝杆菌的PPD只能通过TCR诱发α－β^－CD4＋细胞应答。这些γ－δT细胞大量聚集于结核病变内。与CD4＋－α－βT细胞一样，γ－δT细胞对分枝杆菌感染的巨噬细胞表现强的细胞毒效应活性，并可产生大量的IFN－γ。上皮和黏膜表面γ－δ细胞的存在和其由活的分枝杆菌活化，提示此种细胞可以形成抗结核分枝杆菌早期免疫的第1道防线。

（三）其他免疫细胞在宿主抗结核应答中的作用

第3类淋巴细胞不表达T细胞或B细胞的标记。这些较大的淋巴细胞称为自然杀伤（NK）细胞，在其细胞质内有许多颗粒，并可在无明显的抗原刺激下裂解感染的细胞。细胞内存在的细菌，如结核分枝杆菌能直接或通过刺激巨噬细胞产生IL－12而活化NK细胞，IL－12是一种强的活化NK细胞的细胞因子。NK细胞也可产生IFN－γ，并通过其活化巨噬细胞来增强巨噬细胞对吞入分枝杆菌的杀灭。近期的研究工作表明，NK细胞产生的IFN－γ在原发性宿主防御、抗分枝杆菌保护性免疫以及对抗分枝杆菌感染有关细胞的诱导上都起决定性的作用。此外，有T细胞基因缺陷的严重联合免疫缺陷（SCID）的小鼠仍可使巨噬细胞向感染部位移动，并且在无功能性T细胞存在的情况下，亦可形成有明显组织性的肉芽肿，提示这可能是由分泌IFN－γ的NK细胞所介导的作用所致。由此可见，NK细胞是可能通过诱发肉芽肿形成和巨噬细胞活化，而在特异性免疫出现以前所形成的早期防御机制。

巨噬细胞所带有的典型MHC分子以及其他系统，在生成结核分枝杆菌－特异性细胞应答上是必需的。CD1是一种类似MHC的表面分子，参与T细胞的抗原识别，有提呈非肽抗原（如类脂和脂聚糖）的特殊能力。CD1－限制性的T细胞包括带有α－βTCR的CD4－CD8－双阴T细胞以及CD8细胞和带有γ－δTCR的细胞。双阴T细胞虽可使分枝杆菌感染的靶细胞裂解，但是这种细胞毒机制并不能引起靶细胞内存在的分枝杆菌的死亡，但可将细菌释出，便于活化的巨噬细胞在低感染复数下摄取。此种T细胞亚群主要在免疫调节上起作用，特别是可消除表达于抗原呈递细胞上的抗原，从而下调免疫介导的组织损伤。

呼吸道中尚含有一种在肺部免疫应答生成中起重要作用的细胞群体，称为树突状细胞（DC）。肺部DC有很强的抗原呈递能力以诱发T细胞介导免疫，能表达高水平的抗原呈递性的Ⅰ类和Ⅱ类MHC产物以及CD1分子。DC的前身细胞能吞噬分枝杆菌，并能有效地呈递抗原至T细胞。DC在肺脏中的一种主要的机制性特征为其可捕捉抗原，然后移送至引流淋巴结，用以诱发免疫。活菌感染小鼠后进入淋巴结中方有DC的聚集，而牛型分枝杆菌BCG的死菌制剂就不能诱发这种现象，说明DC在抗分枝杆菌的获得性保护性上起重要作用。

中性粒细胞在宿主抗分枝杆菌感染应答中的作用尚不清楚，但是很有可能也与之有关。特别是在炎症反应的早期。另外，肺泡上皮细胞可在肺部炎症中起作用，在宿主的抗分枝杆菌感染的免疫应答中也可能起一定的作用。

四、结核病中的肉芽肿炎症——细胞相互作用和组织损伤性免疫机制

结核病中T细胞的持续活化将导致细胞内感染组织学标志的肉芽肿形成。吞噬细胞的移动与活化形成有组织的肉芽肿，是对各类感染抵抗力主要成分的一种动态过程，在微生物感染中尤为重要。此种形式的炎症反应可用以局限和防止结核菌的扩散。但它也可由于组织坏死而引起严重的功能不全。如其发生于肉芽肿的中央，则称为干酪样坏死，这种坏死是由于巨噬细胞产物（如溶酶体中的酶类）和ROI所引起的。干酪样肉芽肿和与肉芽肿一起发生的纤维化是结核病中组织病理和临床疾病的主要原因。

结核菌生长与宿主免疫应答之间的相互作用决定疾病的发展或消退。家兔模型中的结核与人体中的疾病比较接近；结核病的各个时期都可用组织学技术在此种实验动物中进行研究。第1期是结核分枝杆菌被吸入后在肺泡巨噬细胞中所发生的感染。取决于肺泡巨噬细胞杀菌能力与结核分枝杆菌毒力，巨噬细胞多能消灭结核分枝杆菌。这些杀灭机制是巨噬细胞的天然抵抗力功能，在此期中与细胞免疫无关。如果原始被感染的巨噬细胞不能消灭感染的细菌，细菌就能分裂，这些巨噬细胞最终被破坏，释出细菌，并可被新近由血流中进入的巨噬细胞和单核细胞所吞噬。即使在感染1周后，对感染有抵抗力家兔肺中所含有的活菌仍较易感家兔肺中所含有者少20倍。

在以后的2周内发生共生性相互关系，即新的巨噬细胞聚集；在易感性和抵抗性的家兔品系中都发生对数期速率的增殖。在组织学上，易感动物病变中的巨噬细胞多位于肺泡内，且其中含有较多的活菌；而抵抗动物病变中者则常位于肺间质中，有抵抗性家兔的间质性炎症浸润由无数在免疫应答上起主要作用的淋巴细胞所组成。自3周以后，即可出现乳酪样坏死的中心，此时就可终止细菌繁殖的对数期，并与迟发型变态反应发生的时间符合。易感动物则有更多、更大的含有更多细菌的乳酪样坏死中心。坏死中心的发生是由于未活化巨噬细胞的破裂而引起的局部组织损伤。其目的在于消除可供细菌生长的细胞内环境。这种反应可能是细胞毒T淋巴细胞活性的结果。

在免疫应答的以后时期中，虽然易感和抵抗性家兔品系均能同样控制细菌的繁殖，但易感动物中的肉芽肿病变增大，结核菌可以从病变的边缘释出，仅被活化不良的巨噬细胞所吞噬。这类宿主能用以控制感染扩散的唯一机制是进一步破坏组织的细胞毒T细胞应答，逐渐地破坏肺部，并可使细菌沿淋巴管和血流扩散。这种情况与人类中的粟粒性结核相似。与之不同的是，有抵抗力的家兔的可产生由相应巨噬细胞扩增T细胞群体而诱发强的细胞介导免疫应答，所发生的肉芽肿病灶中就含有一层高度活化的巨噬细胞和小的乳酪样病变中心周围T淋巴细胞的聚集。这些由T细胞细胞因子（如IFN－γ）所活化的巨噬细胞能吞食和破坏由肉芽肿边缘释出的细菌，并可阻止进一步的组织破坏。原发性结核最终即被包围且发生退化，使疾病能在早期得以被控制。

如果疾病继续发展，则在人类、家兔和豚鼠中都可发生固相干酪样结核病变的液化，最后可形成空洞。这可能是人类结核病的发病机制中最为危险的过程，因为此时有可能通过咳嗽反射使结核菌气溶化，从而感染其他易感人群。此外，凡是既往的有效获得性宿主抵抗力所不能控制的细菌即可大量繁殖，增加了形成具有抗宿主抵抗力的突变性细菌的可能性。空洞的外围四壁由胶原蛋白的外带所组成。它是一种富含毛细血管、成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及一软性的液化中心。引起液化的原因尚不清楚，但液化常与高水平的结核菌素反应性和含有高浓度的能水解固相乳酪样病变物质的蛋白酶裂解成熟巨噬细胞的过程有关。很有可能，这也可能是某些炎症细胞因子，如IL－1和T NFα活性上调的间接后果。

Orme提出，人类、家兔和豚鼠对空洞形成易感性的增高反映了淋巴细胞在分枝杆菌感染的早期有效集中于肉芽肿的能力下降。液化的乳酪样病变物质对于能在细胞外生长的分枝感菌而言是一种极好的培养基。如果空洞病变累及附近的支气管，亦可发生坏死、破裂，并形成空洞，因此干酪样病变物质可排出，并沿支气管扩散至肺的其他部位以及外界环境之中。如果血管位于空洞壁，则当侵蚀物破裂时即可导致出血和咯血的典型症状。这种咯血有时是大量的和致命性的。

五、结核病与HIV的相互关系

与许多感染HIV阳性病人的微生物不一样，结核分枝杆菌是一种有毒力的病原菌，因而在具有极低免疫抑制的个体中亦可引起疾病。就两种感染的流行资料而言，新近统计资料估计约有500万以上的同时为两种疾病感染者。结核病对潜伏感染T细胞中的HIV复制是一种强的活化因素，能导致病毒含量的增加和加速免疫系统的破坏。因此，对新近诊断为结核病人HIV状态的了解至关重要，因为它可决定抗反转录病毒和抗结核治疗是否要开始进行，从而增强病人的生存力。

与HIV相关的免疫抑制恶化时，结核病就成为一种更易于扩散的疾病，使免疫应答减弱，空洞形成较少，病变多不局限于肺尖，肺外疾病较为多见。HIV阳性病人的活动性结核放射学表现不典型，肺结核放射显影表现和CD4T淋巴细胞计数之间有明显的联系。CD4淋巴细胞计数低的病人在胸部X线片中常表现有胸内淋巴结病、胸膜积液、粟粒性或间质性病变。而空洞形成和肺不张则较为少见。双重感染病人的支气管抽取液标本的检查研究发现，与免疫应答正常的结核病人的抽取液相比较，所有类型肺中的免疫细胞数目都有所下降，特别是CD4＋T细胞。这可能是限制有效的局部免疫应答的形成的一种因素，使向肺外早期扩散的危险性增加。

很有可能HIV相关结核病人与免疫正常的结核病人相比较，在显微镜下的免疫组织学发现上也有所不同。在HIV感染的结核病人中，肉芽肿形成不良，在整个肉芽肿中只可见有未成熟的巨噬细胞的分散存在，以及少数的CD8＋T细胞。

总之，同时感染HIV的结核病人对新近感染和潜伏疾病的再活化的危险性都有所增加。虽HIV－相关性结核病对免疫正常者并不具有更高的感染性，但耐药菌株则较为多见，这样就造成了公共卫生方面的危险性。

六、结核分枝杆菌的基因和毒力

至2001年，研究者对结核分枝杆菌H37Rv菌株和另一临床分离菌株的全部基因组已进行了测序，并发现这一细菌约含有4 000个基因。而且很多的基因组均与类脂生成和类脂裂解的酶类有关。此外也在结核分枝杆菌基因组中鉴定出毒力基因，如“细胞溶解素基因”，这种基因与已知致病性细菌菌株的基因，如伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）的YpIQ溶血素基因之间有序列上的同源性。这些基因能编码可溶性蛋白质，它们可将病原菌空泡组分中的抗原肽转运至宿主细胞质中的抗原处理和抗原呈递部位。

研究者并已证实了某些一线抗结核药物突变上的基因作用，如编码异烟肼耐药表型的触酶－过氧化物酶基因katG。另外的研究发现了许多在结核病宿主－病原菌相互作用上有意义的过程，使病原菌能获得抵抗宿主活化巨噬细胞所产生毒性分子的能力。已由致病性结核病临床分离菌中克隆出能对抗巨噬细胞抗菌产物并有利于感染时病原菌生存的新型基因。

近年研究证实潜伏性分枝杆菌可利用脂肪酸作为碳和能量的来源。应用基因信息可鉴定出分枝杆菌酶异柠檬酸盐裂合酶。这种酶是脂肪酸代谢能量产生关键途径中的乙醛酸支路（glyoxylate shunt）的主要作用物。如用同源重组法将结核分枝杆菌菌株中编码此种酶的基因剔除，则所形成突变菌株的毒力明显的减弱。在小鼠模型中证实，这一菌株在体内不能保持原有的潜伏时期，诸如此类的基因研究可用以了解分枝杆菌的持续性感染和毒力的分子机制。

七、结核病分子诊断的新技术

就临床医生而言，结核病的诊断上有两方面的主要问题：第一，如果病人的涂片检查不是阳性，则医生就必须等待数周，以期获得培养检查的结果。此外，在很多情况下无法鉴定细菌，以致医生无法知道细菌对药物的敏感性。第二，即使是感染在开始时就已经为显微检查证实，但仍必须等待漫长时间的培养结果，以期鉴别结核分枝杆菌与其他类型的分枝杆菌。

目前已有可能用测定特异DN A或RN A的DN A探针以核酸杂交方法来鉴定主动生长的分枝杆菌。其中有一系统（Accuprobe，GenProbe，San Diego，CA）即是基于互补性的核酸链与细菌RN A连接以形成稳定的特异性双链复合物的能力而设计的，这种方法能在2 h内鉴定结核分枝杆菌的培养物。

聚合酶链反应（PCR）是一种快速和敏感的方法，可在不需进行培养细菌的情况下鉴定病原菌。PCR是基于用热稳定的DN A聚合酶对病原菌特异的DN A片段进行级数扩增和以后的测定。标本的制备、DN A扩增和检测可以在一个工作日内完成，理论上标本中只要有一个细菌即可被检出，但实际上的限度为10～1 000个细菌。已有许多关于应用PCR检测结核分枝杆菌的实验报告，其中应用了许多不同的靶基因。但尚无一良好的单一靶序列可供临床检验使用。RN A聚合酶β亚单位的核心部位——RpoB序列可用以协助常规微生物诊断技术。

常用的靶序列为IS6110。这一序列对结核分枝杆菌复合体有特异性，可提供多种作用靶以备扩增，近期对以IS6110作为PCR的作用靶的评估确定，原先选作为扩增的区域虽对结核分枝杆菌复合体是特异的，但是这一序列的某些区域也可与其他菌种的插入序列共有同源性。因此在设计基于IS6110扩增的新型PCR时务必注意。

用PCR法扩增16S核糖体RN A基因超变区的一部，再对PCR产物进行测序，可在2～3 d内鉴定分枝杆菌临床分离物的培养菌株。然后可根据所获得的种特异性核苷酸序列鉴定菌种。进来已应用这一技术直接从临床标本和组织标本中鉴定分枝杆菌。

近年Roche分子系统发展了一种新的PCR检定法（Amplicor结核分枝杆菌检测系统），这种方法用生物素化的菌属特异性引物扩增编码16S核糖体RN A基因的DN A序列，然后用一结合于微孔板的对结核分枝杆菌复合体特异的寡核苷酸探针进行试验。整个操作过程能在收到已处理标本后的5～6 h内完成。

另外也有人提出了基于抗原特异性T细胞的检定法，此法在检查新近接触结核分枝杆菌而无症状的个体时，优于结核菌素皮肤试验。他们用结核分枝杆菌特异性ESA T－6分泌的抗原进行ELISPOT检定法以检测抗原特异性效应T细胞，发现这种检定法与接触强度的增加有明显的相关性。

虽然临床标本的显微镜检查和培养法在结核病的诊断上，多年来一直被认为是有效的方法，应用PCR和DNA序列鉴定则为快速诊断、流行病学研究以及快速鉴定耐药菌株提供更为有效的方法。

（余传霖）

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