儿童病毒感染的免疫发病机制

第二十二章　儿童病毒感染的免疫发病机制

根据最近联合国世界卫生组织的估计，每年约有1 500万人死于经呼吸道传染的疾病；而死于胃肠道感染疾病者只有500万人。这些死亡的病例多见于儿童，因此儿童中的病毒感染对全世界儿童的健康造成了很大的威胁。

一、免疫防御

免疫系统由多层次的防御机制所构成。这些机制包括对病原体侵入的被动屏障、具有抗菌活性化学物质的主动作用、鉴别非己成分的方式和许多破坏病原体分子结构或停止其在感染细胞中复制的方法等。病原体在体内首先所遭遇的是先天性免疫，以后则是获得性免疫。其中有多种过程自主和协同地平行发生。虽然这种防御网络极为复杂，但对免疫防御机制的个别组分，目前在很大的程度上已能在分子水平上加以了解。免疫防御机制的主要组成如表22－1所示。

表22－1　免疫防御机制总结

（续　表）

有关病毒逃避宿主免疫攻击和对抗免疫系统的方式的研究刚刚起步。近期有一项研究发现，RSV附着蛋白G的中央保守区与T NFα有结构上的同源性，提示RSV有对抗人类免疫系统的可能性。

二、儿童病毒感染的流行病学

学龄前儿童每年可患5～10种病毒性上呼吸道传染病，而成年人只患2～5种。婴儿中的呼吸道病毒感染特别严重。病毒性细支气管炎是西方国家中婴儿住院的最常见的单一原因，引起美国每年91 000个病例。约有70%的病毒性细支气管炎是由RSV所引起的。目前已可用现代技术来确定70%伤风病例的病因。

在儿童中有5种主要的急性呼吸道感染的临床表现，即伤风（UR TI）、喉气管支气管炎（哮吼，有或无会厌炎）、急性支气管炎、急性细支气管炎和病毒性肺炎。Issacs等总结了由各种不同病毒所引起疾病或综合征的特征（表22－2）。

表22－2　儿童呼吸道感染的病毒及其致病性

在较大的儿童和成年人中60%的伤风病例由鼻病毒引起；约15%的伤风病例由冠状病毒引起。其他病毒引起的伤风病例的比例都低于10%。引起上呼吸道症状的其他病原体包括肺炎支原体、肺炎衣原体、麻疹病毒、呼肠孤病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒、人类肺炎后病毒（human metapneumo－virus）和巨细胞病毒。

不同病原体以不同的方式传播：RSV主要通过与被鼻腔分泌物污染的表面或物质的直接接触而播散。在接触RSV感染儿童的成年人中，有40%可被感染，但是坐于有感染儿童的室内，但并未触及污染的表面或病儿者很少被感染，飞沫传播并不多见。鼻病毒因其沉积于鼻道则常通过空气中飞沫传播。

三、病毒的致病机制

病毒侵入体内的原发部位为结膜、鼻腔、咽部或肺部。呼吸道上皮细胞是首先被感染的细胞群体，但是不同病毒所致细胞病理变化的程度有所不同。许多伤风病毒并不引起特殊的细胞病理变化。Kagi等曾将病毒区分为溶细胞性和非溶细胞性两大类。但也有事实表明，同一病毒可对一些细胞型具有破坏性，而对其他同一宿主的细胞却不能引起感染，或只能引起低水平的持续性感染。

伤风病毒实验接种后的播散在2～7d时达到最大限度。鼻部活组织检查显示典型的黏膜下水肿，后继之以纤毛上皮细胞的脱落，常有上皮细胞和固有层中中性粒细胞浸润增加。流行性感冒病毒感染时则有广泛的直接细胞损害。因为鼻病毒和RSV感染并不引起特殊的细胞病理变化，故不大可能是直接的病毒损害引起感染的症状。而有可能是因为感染结果所释放出的趋化因子和细胞因子而引起黏膜分泌大量增加和打喷嚏。患有急性上呼吸道感染儿童的鼻腔抽取液中的IL－1，IL－6，IL－8和TNFα的水平增高。

伤风病毒并不引起病毒血症，其局部的扩散仅限于上呼吸道，包括鼻窦和咽鼓管。但最近发现外周血中有的细胞在急性RSV感染时可以含有病毒RNA。很有可能由循环中抗原呈递细胞所携带的外周病毒是无致病能力的退化病毒的传播，在外周血细胞中存在有负链和正链的RNA提示病毒具有复制的能力。但是这种发现在致病机制上的意义尚不清楚。

在组织培养中比较容易用人类RSV建立人或动物来源的多种细胞类型中的持续性感染。虽然RSV与麻疹病毒密切相关，但在人类中并未发现有慢性RSV疾病。在豚鼠中曾发现有持续性病毒感染。

四、RSV感染时的免疫保护和损害

上呼吸道局部产生的免疫球蛋白常与抗感染的保护力有关，高水平的母体抗体可能是8周龄儿童很少为RSV感染的原因。一般至6个月以上时即可发现有母体抗体水平的下降，因为在2～4个月疾病发生最多且较为严重之际即无保护力。

在小鼠的RSV疾病模型中发现，原发感染的前5天所发现的主要淋巴细胞的表型为CD4－CD8－（裸细胞），其中多数具有自然杀伤（NK）细胞的特征，此时可达到高峰。当病毒从肺部清除时（6～9d），主要的细胞亚群为CD8＋T细胞，但也可发现有CD4＋T细胞。在小鼠中的不同形式的免疫病理可用T细胞产生2型细胞因子来解释，这些细胞因子可以识别主要表面糖蛋白G，而T细胞产生的1型细胞因子则对融合蛋白和次级基质蛋白有特异性。说明T细胞能使疾病加剧的有力证据是被动免疫传递的研究结果。感染RSV小鼠仅表现为轻微的疾病，但如将能识别RSV的T细胞注入小鼠后，疾病的严重性明显增加。1型辅助性T细胞（Th1）或CD8＋细胞毒T淋巴细胞（CTL）能引起肺出血，而CD4＋T细胞则可产生2型细胞因子，引起肺部的嗜酸性粒细胞增加。相反，抗体的传递绝不会引起体内疾病的加剧，而有时尚可保护宿主免受感染。

有些，但不是所有的小鼠品系，在用表达附着蛋白G的重组牛痘病毒致敏后发生嗜酸性粒细胞增加。C57BL/6小鼠在被RSV攻击时发生肺部嗜酸性粒细胞增加的抵抗性，取决于CD8＋T细胞分泌的IFN－γ。对嗜酸性粒细胞增加抵抗性的机制在不同的品系中有所不同，而且无一H－2 ^k小鼠能形成肺部的嗜酸性粒细胞增加。

多年前即已得知，附着蛋白G有膜结合型和分泌型两种形式。分泌形式被认为是一种抗体的引诱物，因为抗体应答的主要组分多系针对蛋白G的。近期证明蛋白G的分泌型在以后RSV攻击时，较之膜结合型能引起更为明显的肺部嗜酸性粒细胞增加。此种差异的原因可能是由于抗原处理和提呈的方式不同所致。

为了明确如何控制嗜酸性粒细胞的增加，首先必须了解辅助性T细胞的分化途径。主要是产生IFN－γ的细胞（N K细胞和CT L）通过使未致敏的辅助性T细胞向IFN－γ产生方向分化。在缺少有效的早期IFN－γ应答的情况下，Th2 T细胞（即能产生IL－4和IL－5者）的产生就是一种有欠缺的途径。主要表面糖蛋白G无诱发有效细胞毒T细胞应答的能力，故在免疫应答中，IFN－γ的产生上是有缺陷的。G－蛋白确能产生强的辅助性T细胞应答。G－特异性辅助性T细胞能产生IL－4和IL－5，故可使肺部的嗜酸性粒细胞增加加强。

在BA LB/c小鼠中融合（F）蛋白的致敏可诱发CD4＋T细胞和细胞毒性的CD8＋T细胞的生成。在此情况下，CD4＋T细胞产生1型细胞因子。用基因工程方法可使能表达G－蛋白的牛痘病毒表达CD8＋T细胞上的M－2蛋白表位。用这种融合蛋白抗原致敏后，在以后攻击时即可大大地使嗜酸性粒细胞增加减慢。体内CD8＋T细胞或IFN－γ的缺失，或对CD8＋T细胞功能缺陷的小鼠致敏时亦可导致肺部嗜酸性粒细胞增加有所增强。这些事实均支持CD8＋T细胞产生IFN－γ是调控CD4＋T细胞的2型细胞因子产生的关键。

RSV的基因修饰能产生可防止感染并不引起病变加重的有效疫苗。特异性消除能诱发CD4＋T细胞的重要表位以后，即可使G－蛋白丧失使致敏动物诱导肺部嗜酸性粒细胞增加的能力，但却可保持G－蛋白诱发保护性免疫的能力。此种发现证实了利用分子免疫学和动物模型以解决病毒发病机制问题和产生新型疫苗。

即使在对小鼠的研究中对T细胞在保护性和疾病增强的作用上有了一些了解，但在人类中的研究仍不多见。Roman等证实因RSV感染而住院的婴儿外周血单核细胞中有IFN－γ和IL－4的释放。感染婴儿表现外周血中B细胞增加和CD4＋T细胞减少。同时有IFN－γ产生的抑制，提示这是一种类似Th2应答的反应。

五、儿童感染中的迟发效应

（一）病毒感染与哮喘的关系

病毒不仅引起急性效应，而且早期儿童中的严重感染常伴有儿童中的晚期复发性喘息。患有细支气管炎的儿童在开始的7～10年中易于发生喘息，而且其中多数在以后即诊断为哮喘。

1.哮喘加剧　伤风是哮喘加剧的最为常见的病因，发生于80%的急性发作病人。在90%的伤风病人中均伴有哮喘症状的增加。有几种机制可用以解释哮喘加剧，例如病毒感染后所引起的局部炎症反应、上皮细胞的消失、由肺部清除物质的障碍以及抗原侵入的增加从而导致空气变应原致敏作用的化学受体含有量的改变等。病毒感染后的加剧尚可与哮喘病人中细胞因子应答改变有关。这些细胞因子中有的还可以引起肺部的长期中性粒细胞聚集。

2.病毒感染在哮喘发生中的病因作用　呼吸道疾病除了引起已有哮喘加剧以外，也可在诱发哮喘上起病因作用。Sigurs等报告，在平均年龄为3.5个月的47例患有细支气管炎的住院婴儿中，有23%的病例在以后3年内被诊断为哮喘，而对照组为1%。患有细支气管炎者血清中IgE抗体阳性者有32%，而对照组为9%。Murray等报告，在73例儿童历时5.5年的研究中，因婴儿细支气管炎住院的儿童中有42.5%发生喘息，而对照组为15.1%。患有RSV细支气管炎儿童中的呼吸道症状可持续8～13年，组胺反应性的高敏反应可持续10年以上。虽然这些研究提出了RSV细支气管炎与哮喘之间的病因联系，但并不能排除哮喘和细支气管炎遗传素质的可能性。过去20余年哮喘发病率的迅速增加不可能是因为遗传危险因素的改变，而是由于环境中的变化。必须认识到当今儿童所遭受的遗传危险因素的威胁显然与其父母辈是不相同的。

动物实验结果支持病毒细支气管炎与哮喘间的病因联系。Brown Norway大鼠在细支气管炎后可发生慢性可逆转性的呼吸道阻塞发作，并可观察到有CD4＋T细胞应答和IFN－γ产生的下降，从而引起呼吸道中的改变，包括持续性炎症、纤维化、细胞外基质物质沉积。RSV细支气管炎的动物模型中尚可发现与一般原病毒感染中Th1T细胞应答不同的针对RSV主要表面糖蛋白G在某些小鼠品系中所出现的Th2细胞优势。RSV攻击后的肺部嗜酸性粒细胞增加与G－蛋白不具备刺激CD8＋T细胞的能力相关，这也强调了CD8＋T细胞的重要非裂解细胞作用。CD8＋T细胞也可表现1型和2型细胞因子产生程式（Tc1和Tc2），在决定CD4＋表型上也有重要作用。

同时接触呼吸道病毒和变应原时，即可导致它们之间的相互作用，从而引起哮喘发生。特应性（atopy）和同时存在病毒疾病的联合作用，较之单一因素对于急诊室中患有急性呼吸道阻塞的儿童具有更大的危险因素作用。将16型鼻病毒接种至过敏性鼻炎个体内时能改变变应原支气管激发反应，有利于晚期应答的发生。有关呼吸道炎症和超敏反应提示病毒在特定条件下可诱导形成哮喘表型。动物实验结果支持这一论点。未感染的小鼠对吸入的抗原（如卵白蛋白）不产生IgE抗体，但在急性流行性感冒时则可对此抗原发生致敏作用。如果抗原接触与流感感染同时发生，则对吸入的乙酰甲胆碱（methacholine）呼吸道反应性增加，血清IgE水平上升，而仅有流行性感冒A型病毒或卵白蛋白时都不能产生这些变化。这些变化提示病毒炎症反应可使吸入的抗原穿过呼吸道屏障增强致敏作用。

总之，早年发生的病毒感染能影响晚期肺部疾病发生的机制包括：①慢性病毒感染，持续性、潜在性；②局部解剖的永久改变；③肺部的生长缺陷；④其他急性或慢性感染的发生；⑤免疫耐受性；⑥局部免疫状态的形成；⑦呼吸道感染时空气变应原的致敏。

（二）儿童感染的保护效应

常见儿童感染在过敏性疾病的发生上表现保护效应的可能性，这首先是1958年在英国所进行的一项联合研究所提出的。1994年Strachan报告早年的反复感染可以防止枯草热的发生，另外Guinea－Bissau的研究证实以往曾患麻疹的儿童较之麻疹接种的儿童更不易发生特应性疾病。Martinez等检查3岁以下儿童下呼吸道疾病（LRI）与特应性及血清IgE水平的关系时发现，非喘息性LRI较之喘息性和无LRI者更易与低IgE水平和低皮肤反应性相关。非喘息性LRI的9个月儿童较其他组儿童有较高的IFN－γ产生。他们认为这些儿童体内的抗病毒免疫应答可导致Th1细胞的选择和Th2细胞的抑制。

感染对特应性疾病发生的保护效应也有其可能的免疫机制。特应性与变应原特异性应答的表达有关。这种应答可产生Th2型细胞因子，如IL－4和IL－5，从而促进Ig E产生和嗜酸性粒细胞增加。在非特应性个体中，T细胞系统偏向于Th1表型，产生IFN－γ，抑制Th2细胞。表现Th2表型的胎儿来源变应原反应性T细胞也存在，表明有一种子宫内的致敏作用发生。这些胎内变应原特异性Th2应答可延续至婴儿期，表现为产生IFN－γ能力降低。这种情况并可在特应性婴儿中发现。环境因素，如病毒和其他细胞内寄生细菌（如分枝杆菌）能在早年表现作用，并协助获得性免疫应答的成熟，成为Th1－依赖性系统。巨噬细胞和树突状细胞受到刺激后产生IL－12，其能诱导N K细胞和Th1细胞产生IFN－γ。IFN－γ则能提供一种可供抗原特异性CD4＋T细胞分化的内在环境，使Th1细胞和CD8＋T细胞分化成Tc1细胞。这种细胞能产生高水平的IF N－γ，如果缺少这些早期刺激物，则偏向Th2的免疫系统起作用，并确立变应原特异性应答，从而表达特应性表型。

有很多事实说明在与病原体接触后有助于出生时的Th2细胞因子程式转向以后儿童期时的Th1细胞因子程式的成熟过程。特应性体质的儿童中的这种成熟过程较为缓慢或表现不足，但可因反复接触食入或吸入的细菌或因儿童期的病毒感染而增强。这一参数的改变可能是近年发达国家中特应性疾病和哮喘增加的原因。

六、免疫治疗和免疫接种的展望

有两个主要问题妨碍有效疫苗的发展，特别是对那些具有最大危险性的婴儿而言：第一，事先的免疫能使自然疾病的严重性增加；第二，自然感染对再次感染并不能产生牢固的交叉反应性或特异的保护性。

再次感染问题有几种可能的解决方法，其中之一是发现抑制有效免疫应答而使再次感染发生的病毒组分。这些调制元素的缺失或者其他抗调制元素的表达都可用以设计有效的疫苗。另外，用活的减毒病毒进行黏膜免疫，至少也能诱发针对再次感染的暂时保护力。

目前在蛋白质亚单位疫苗、活的RSV减毒毒株、DN A疫苗和合成肽疫苗等的研究方面都有了进展。曾在支气管肺部发育不良和囊性纤维化儿童中用纯化的融合蛋白进行临床试用，均获得良好的结果。另外尚可用同一制剂免疫正在母乳喂养的妇女，以期保护出生数月的新生儿免受RSV感染。免疫接种后可引起母乳中RSV－特异性抗体产生，且无任何不良反应。

近年来有关分离RSV感染性c DN A克隆和产生新的重组病毒的技术对于病毒学工作者而言极为有用。目前已发表的研究报告已扩展到利用反向遗传学基因工程改造温度敏感突变和细胞因子基因。有可能在克服致病性转变问题的情况下利用基因工程改造突变，但是RN A病毒即使在感染单一个体的情况下，也具有明显的再次激发致病性基因型的能力。

曾在黑猩猩中试用反向基因工程活减毒疫苗。这种新型重组体能在感染的培养细胞中产生大量的IFN－γ，在小鼠呼吸道中生长不良，但可诱导对再次感染的牢固保护力。产生的IFN－γ能使病毒不能复制，且对疫苗的免疫原性无影响。但这种疫苗尚未在人体中试用。

裸DN A的免疫接种也有一定的希望。Li等人证明当肌肉注射编码RSV融合蛋白的DN A质粒给小鼠时，能诱发强的免疫应答。这种疫苗尚可诱生抗体、细胞毒T细胞、释放IFN－γ的CD4＋T细胞，并可保护小鼠中活病毒的攻击。此外，它尚可将已形成的Th2应答转变为Th1表型。接种的途径很重要，因为肌内注射致敏法产生Th1应答；而皮内注射致敏法则有利于Th2应答形成。

对原发性感染而言，被动免疫治疗只是在高危季节经选择的儿童中应用。人源化单克隆抗体可用于高危儿童。并证实在防止支气管肺部发育不良儿童的发病上甚为有效。在动物研究中发现有一低分子量的Fab片段在吸入应用后也很有效，提示局部应用于肺部可能在人类中是有利的。气管内应用抗体在新生小牛中的应用也是有效的。但是免疫球蛋白治疗的价格甚高，应当予以考虑。

利巴韦林（Ribovirin，病毒唑）对RSV疾病的作用尚待证实。这一药物虽在体外有抗病毒作用，但其有效作用看来是由于其免疫调节功能，而并非抗病毒功效。另外还有一些抗病毒化合物正在发展，而且也可能有些希望。

（余传霖）

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