免疫原的制备

一、免疫原的制备

免疫原是能激发机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。免疫原的纯度可直接影响免疫血清的特异性，因此抗体制备的首要步骤是制备并纯化免疫原。天然的免疫原绝大多数是多种成分的混合体，所以必须从复杂的混合体中提取出某种单一成分，经纯化后才可用做免疫原制备相应的抗体。根据免疫原的性质及来源不同，其纯化方法也有所不同。

（一）颗粒性免疫原的制备

天然的颗粒性免疫原主要是指人、动物或寄生虫的细胞以及细菌细胞抗原等，制备方法相对较简单。

1.绵羊红细胞的制备　绵羊红细胞是制备溶血素的免疫原，制备方法是采集健康绵羊的静脉血，立即注入无菌带有玻璃珠的三角烧瓶内，充分摇动15～20 min，除去纤维蛋白，即得抗凝绵羊全血。免疫动物前，取适量抗凝血于离心管中，以无菌生理盐水洗涤细胞三次（2000 r/min，每次10 min），然后取压积红细胞，稀释成10⁶/mL浓度的细胞悬液即可。

2.细菌免疫原的制备　选用经鉴定合格的标准菌株，接种于固体或液体培养基，置温箱37℃培养24 h。菌体抗原经100℃水浴2～2.5 h杀菌并破坏鞭毛抗原即可应用。而鞭毛抗原要选用有动力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛处理。有些寄生虫卵也可制成抗原悬液供免疫用。

（二）可溶性免疫原的制备

蛋白质、细菌毒素、糖蛋白、脂蛋白、酶类和核酸等均为可溶性抗原，它们大部分来源于组织和细胞，成分复杂，免疫动物前需要进行纯化。其制备过程如下：①选取合适的组织和细胞并将其破碎。②选用适当的方法从组织和细胞匀浆中提取目的蛋白或其他抗原。③采用层析法等将可溶性抗原进一步纯化。④鉴定抗原的纯度。

1.蛋白质抗原的制备　不同的蛋白质结构不同，它们的溶解度也不相同，大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂。

（1）水溶液提取　由于蛋白质大部分溶于水、稀酸和稀碱溶液，因此提取蛋白质以水溶液为主，其中尤以稀盐液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度高。

（2）有机溶剂提取　一些不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液的蛋白质和酶，常用不同比例的有机溶剂来提取。如用70％～80％乙醇提取麸蛋白。

2.核酸抗原的制备　核酸分为两大类：一类为核糖核酸（RNA），另一类为脱氧核糖核酸（DNA）。核酸是两性化合物，在一定的pH值溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有机溶剂。细胞内的核酸常和蛋白质结合成核蛋白，两种核糖核蛋白的溶解度与溶液电解质的浓度、酸碱度有关，调节电解质溶液的浓度和酸碱度，可使核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白分离开来。

（1）RNA的提取　RNA在细胞中主要有三种类型：mRNA代谢不稳定，提取时要求条件较严格；分离tRNA时，将细胞破碎，用酸处理即可得到沉淀物；rRNA占全部RNA的80％以上，比较稳定，一般提取的大分子RNA主要来源此部分。提取核内rRNA时常先将细胞核分离后再进行，以避免其他细胞组分RNA的干扰。

（2）DNA的提取　DNA主要存在于细胞核中，天然状态的DNA绝大多数是以脱氧核糖核蛋白形式存在。常用的方法是以1 mol/L氯化钠溶液抽提，得到的脱氧核糖核蛋白溶液与含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振荡，除去蛋白质即可。

3.脂多糖抗原的制备　脂多糖是革兰阴性菌细胞壁中的重要成分，对宿主有毒性，即革兰阴性菌的内毒素。内毒素只有当细菌死亡裂解或用人工方法破坏细菌细胞后才能释放出来。常用苯酚法提取脂多糖。

（三）半抗原免疫原的制备

半抗原是低相对分子质量的化学物质，例如多肽、多糖、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物（包括抗生素）以及其他化学物品等。这些小分子物质无免疫原性，只有把这些半抗原与蛋白质载体或与高分子聚合物结合，才能刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞。半抗原与载体结合的方法有物理法和化学法。物理吸附的载体有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硫酸葡聚糖和羧甲基纤维素等，其通过电荷和微孔吸附半抗原。化学法则是利用功能基团将半抗原连接到载体上。

1.载体的选择　载体有蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物和某些颗粒等。蛋白质是一种良好的载体，常用的有人血白蛋白、牛血白蛋白和牛甲状腺球蛋白等，其中牛血白蛋白溶解度大，免疫活性强，又易获得，所以最为常用。

2.半抗原-载体连接方法　半抗原结合到载体上的数目与免疫原性有关。一般认为应连接20个以上的半抗原，才能有效地产生抗体。根据半抗原的化学结构不同，它们与载体连接的方法亦不同，主要有以下三种形式：

（1）带有游离氨基或游离羧基以及两种基团均有的半抗原，可直接与载体连接，如脑啡肽、胃泌素、胰高血糖素、前列腺素等多肽激素类。羧基可用碳化二亚胺法和混合酸酐法与载体氨基形成稳定的肽键。而带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合，还可借助双功能试剂如戊二醛等与载体氨基连接。

（2）带有羟基、醛基、酮基的半抗原，如多糖、醇、酚、核苷以及甾族激素等，不能直接与载体连接，需要用化学方法改造成羧基后才能与载体连接。例如琥珀酸酐法可将带羟基的半抗原改造成带羧基的半抗原琥珀酸衍生物等。

（3）芳香族半抗原，由于其环上带有羧基，它邻位上的氢很活泼，极易取代，因此可先将羧基芳香胺与氨基苯丙酸或对氨基马尿酸等进行重氮化反应，然后用碳化二亚胺法使半抗原上的羧基与载体氨基缩合形成肽键；也可让半抗原的羧基先与载体缩合，再进行重氮化反应。

3.免疫原的鉴定　纯化抗原的鉴定方法较多，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳法、结晶法、免疫电泳法、免疫双扩散法等。仅用一种方法无法作纯度鉴定，只有几种方法联合应用才较可靠。蛋白质抗原的定量常用生化分析方法，根据测试抗原量的多少可用双缩脲法或酚试剂法。如果抗原极为宝贵，可用紫外光吸收法。

（四）免疫佐剂

佐剂是指与抗原一起或预先注射于机体，能够增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。佐剂本身可以有免疫原性，也可不具备免疫原性。

1.常用的佐剂　很多物质都可作为佐剂，通常按有无免疫原性分为两类：一种是本身具有免疫原性的佐剂，如细胞因子、微生物及其产物，包括百日咳杆菌、结核分枝杆菌以及细菌脂多糖等；另一种本身无免疫原性，如液状石蜡、羊毛脂、氢氧化铝、表面活性剂等。目前应用最多的是弗氏佐剂。它是由液状石蜡、羊毛脂和卡介苗混合而成。弗氏佐剂又可分为两种：①不完全弗氏佐剂，是由液状石蜡与羊毛脂按（1～5）∶1比例混合而成。②完全弗氏佐剂，在不完全佐剂中加入卡介苗（终浓度为2～20 mg/mL），即成为完全弗氏佐剂。在免疫动物时，应先将弗氏佐剂与抗原按1∶1体积比混匀，制成“油包水”的乳化液。

2.佐剂的作用机理　佐剂的作用机理较为复杂，至今尚未完全清楚，归纳起来主要有以下几种：①可以增加抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。②佐剂与抗原混合可改变抗原的物理性状，易于刺激机体局部引起肉芽肿，延长抗原在局部组织的贮存时间，使抗原缓慢释放。③增强巨噬细胞的吞噬作用，刺激淋巴细胞增生，从而促进体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能。