抗血清是抗体还是抗原

二、免疫血清的制备

纯化抗原免疫动物的血清是制备免疫血清的通用选择。由于纯化抗原常带有多个抗原决定簇，免疫动物后可刺激产生针对同一抗原不同决定簇的抗体，所以免疫血清实质上包含了多种质与量均不同的抗体，故称多克隆抗体。其特异性和效价与免疫原的种类、免疫动物的方式有关。

（一）选择免疫动物

1.动物的种系与个体　一般来说，抗原的来源与免疫动物的亲缘关系越远，免疫原性越强，产生的免疫效果越好。而同种系或亲缘关系较近者，免疫效果差，甚至不产生抗体。例如鸡与鸭、兔与大鼠之间不适于作免疫动物。动物的年龄与健康状况可影响所产生抗体的效价，年龄太小者容易产生免疫耐受，而年老体衰者，免疫应答能力低下，不易产生高效价抗体。所以选择的动物必须是适龄、健壮、体重符合要求的正常动物，最好为雄性。

2.抗原的性质　对于不同性质的免疫原，适用的动物亦有所不同。蛋白质抗原适用于大部分动物，但有些动物体内因为有类似物质或其他原因，对某些蛋白质免疫反应极差，如家兔对胰岛素、绵羊对IgE、山羊对多种酶类均不易产生抗体。因此，酶类抗原宜选用豚鼠，甾体激素宜选用家兔作为免疫动物。

3.抗血清的要求　对免疫血清需求量大时，应选用马、驴或绵羊等大型动物，若需求量少则可选用家兔、豚鼠或鸡等小型动物。另外，按免疫动物的不同，所获得的抗体有R型（rabbit）和H型（horse）之分。R型是用家兔等小型动物免疫后产生的抗体，具有较宽的抗原抗体反应等价带，适用于作诊断试剂；H型是用马等大型动物免疫后获得的抗体，抗原抗体反应等价带较窄，一般用作免疫治疗（抗毒素血清）。

（二）确定免疫方案

1.免疫原的剂量　免疫原的接种剂量根据抗原本身免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。一般认为，免疫原的剂量适当加大，时间间隔适当延长，可获得高效价的抗体，但免疫原剂量过大或过小都容易引起免疫耐受。第一次免疫时免疫剂量不宜过大，以免接种过量的免疫原，导致免疫麻痹；加强免疫时可增大抗原剂量。大型动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5～1 mg/只，小型动物约0.1～0.6 mg/只。

2.免疫途径　抗原进入机体的途径与抗原的吸收、代谢速度有很大的关系。常用的免疫部位有静脉、肌肉、皮下、皮内、腹腔、淋巴结、脾脏等。皮内或皮下接种时一般采用多点法注射，如足掌、背部两侧、耳后和腋窝淋巴结周围等处。若抗原稀少，可采取淋巴结内微量接种法。静脉或腹腔注射法多用于颗粒性抗原或加强免疫接种。

3.免疫间隔时间　免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，尤其是首次免疫与第二次免疫接种的间隔时间。首次免疫接种后，因机体正处于识别抗原和进行B细胞活化增殖阶段，如果很快进行第二次抗原刺激极易造成免疫抑制。一般蛋白质抗原以间隔10～20 d为优，第二次后间隔7～10 d加强免疫一次。若间隔时间太长，则刺激变弱，抗体效价不高。而半抗原的接种间隔要求长一些。

（三）采血

在采集免疫血清之前，要预先进行抗体效价测定。若抗体效价达到要求，应在末次免疫后一周内及时采血，否则效价将会下降。因故未及时取血，则应补充免疫一次（肌肉、腹腔或静脉内注射，不加佐剂），5～7 d后取血。常用的动物采血法有以下几种：

1.颈动脉放血　这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。于动物颈外侧做皮肤切口，分离出颈总动脉，用丝线将远心端结扎，近心端用止血钳夹住，剪断血管，用固定止血钳将断端放入无菌瓶口，慢慢打开止血钳，动脉血立即喷射入瓶。此方法放血的速度快，动物死亡也快，取血量略少于其他放血法。放血量至动物血总量的一半时，暂时将动脉夹住片刻，再继续放血，获得的血量可以增加。

2.心脏采血　将动物固定于仰卧位，在其胸壁探明心脏搏动最明显处，用16号针头与胸壁呈45°角穿刺。本法常用于家兔、豚鼠和鸡等小型动物，但操作不当，容易引起动物中途死亡。

3.静脉采血　可选用家兔的耳中央静脉和山羊的颈静脉采血。这种放血法可隔日一次，因此采集血液量多。如用耳静脉切开法，一只家兔可采百余毫升血液。用颈静脉采集绵羊血，一次可采集300 mL，放血后立即回输等量10％葡萄糖盐水，三天后仍可重复采血。动物休息1周，再加强免疫一次，又可再次采血，一只羊可获1500～2000 mL血液。小鼠取血往往采取断尾或摘除眼球法，每只小鼠可获得的血液一般不超过2 mL。

（四）分离、鉴定和保存免疫血清

1.免疫血清的分离　采集血液后，应立即分离出血清。分离免疫血清通常采用室温自然凝固，再置于37℃温箱1 h，然后4℃冰箱过夜，待血块收缩后分离血清。

2.免疫血清的鉴定　抗血清的纯化过程会造成抗体绝对含量和活性的损失，因此，血清在应用或贮存之前还应该进行抗体效价的测定以及抗体特异性、纯度和亲和力等的鉴定。

3.免疫血清的保存　保存抗血清的方法主要有三种：①4℃保存，抗血清在鉴定纯化前可保存在4℃冰箱内，为防止细菌污染可将血清过滤除菌或加入防腐剂，保存的期限为三个月或半年。②冷冻保存：是常用的抗血清保存方法，将抗血清分装保存于–20～–70℃，可保存2～3年且抗体效价无明显下降，但要避免反复冻融。③真空干燥保存：抗血清分装后，用真空干燥机进行干燥，制成干粉（水分≤0.2％），密封后在普通冰箱内保存4～5年抗体效价无明显变化。

（五）免疫血清中抗体的纯化

单价特异性是指血清只与其特异性抗原发生反应。有时免疫原不纯，含有微量的杂抗原（性质相近的），制得的抗血清中出现2～3种杂抗体。即使用纯抗原，也会出现抗血清的不纯，因此使用前必须进行纯化。

1.单价特异性抗体的纯化　可以用亲和层析法将交叉杂抗原交联到琼脂糖珠4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲和层析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是单价特异性抗体。也可用吸附剂法，用不含免疫动物抗原的其他杂抗原液做成固相吸附剂，直接加到抗血清中（约1/10），杂抗原则与杂抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。有时杂抗原较少，其他蛋白也少，加入戊二醛后不形成胶冻状，此时可加入无关蛋白进行交联，如牛血清蛋白、兔血清、马血清、卵白蛋白等。加入量以达到总蛋白的2％～3％为宜。

2.IgG类抗体的纯化　特异性IgG的制备方法有粗提法、离子交换层析法、亲和层析法、酶解法等。

粗提法大多用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法。硫酸铵盐析法需经过多次沉淀，IgG组分中还含其他杂蛋白，会产生干扰，因此盐析法粗提的γ球蛋白只能用于一般的实验，或者是抗体效价较高的抗血清。离子交换层析法提取IgG简便，不损坏抗体，既可小量提取，也可大量制备。最为常用的离子交换剂是QAE纤维素。亲和层析法是将纯化抗原或粗制抗原（如是单价特异性则对抗原要求不高）交联Sepharose4B制成亲和层析柱，将抗血清经层析柱过滤洗去未结合的杂蛋白，再用硫氰酸钾洗脱，流出的是纯化的特异性IgG抗体。