酶联免疫吸附技术

二、酶联免疫吸附技术

ELISA于1971年由瑞典学者Engvall和Perlmann最先用于微量IgG定量测定。使得酶标抗体技术得以发展成为液体标本中微量物质测定的方法。目前，临床上ELISA被广泛应用于各种病原体尤其是病毒的抗原或抗体的检测。

（一）基本原理

将已知抗原或抗体结合到固相载体表面，此过程称为包被，与待测抗原或抗体反应形成固相免疫复合物，再用酶标记物与固相免疫复合物发生特异性反应，加入酶底物及色原后呈色，呈色程度用吸光度值（A）表示，所测A值与待测抗原或抗体水平呈相关关系。

（二）固相载体

固相载体在ELISA中作为吸附剂和容器，不参与抗原抗体反应。可作为ELISA载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式，而且价格低廉，所以被普遍采用。

最常用的ELISA载体的形状为微量反应板，称为ELISA反应板，国际上标准的微量反应板为8×12的96孔式或4×12的48孔式。ELISA反应板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可用仪器迅速读出结果。良好的ELISA板应该有吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近等特点。

（三）技术类型

ELISA既可用于可溶性抗原测定又可用于抗体的测定。根据测定原理和步骤不同，分为以下技术类型：

1.夹心法　夹心法有双抗体夹心法和双抗原夹心法两种。双抗体夹心法是检测含有两个或两个以上抗原决定簇的多价抗原时常用的方法，基本步骤如下。①包被抗体：将已知特异性抗体包被于固相载体上，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体等杂质。②加待测标本并温育：使待测抗原与固相抗体结合，形成固相抗体-抗原复合物，洗涤除去其他未结合的物质。③加酶标抗体并温育：使固相抗体-抗原上的游离抗原决定簇与酶标抗体结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体复合物，洗涤除去未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。④加底物显色：固相抗体-抗原-酶标抗体复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据显色反应程度对抗原进行定性或定量分析（图6-7）。

图6-7　双抗体夹心法原理示意

同理，将可溶性抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

2.双位点一步法　双位点一步法是在双抗体夹心法的基础上，应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的McAb分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时可同时加入待测抗原和酶标抗体进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定（图6-8）。

图6-8　双位点一步法原理示意

双位点一步法中，当标本中待测抗原浓度过高时，过量的抗原会分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，导致测定结果低于实际含量，称为钩状效应。钩状效应严重时甚至出现假阴性结果，必要时需将标本稀释后重新测定。

双位点一步法简化了操作，缩短了反应时间，提高了敏感性与特异性，因此临床上测定大分子抗原物质均采用该技术，如乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的测定。

【原理】

于抗乙型肝炎病毒表面抗原（抗-HBs）包被的微量反应板孔中，加入待测标本和酶标记抗-HBs，若标本中含有HBsAg，则形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶底物显色，可根据显色程度对抗原进行定性和定量分析。

【试剂与材料】

（1）HBsAg诊断试剂盒（酶联免疫法）。

（2）待测血清：静脉采血2 mL，离心分离血清备用。

（3）37℃水浴、酶标仪等。

【操作步骤】

（1）平衡　取出试剂盒置室温30 min以上。

（2）稀释洗涤液　浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释备用（稀释倍数根据具体试剂盒）。

（3）设置对照　每板应设阴性对照2孔，阳性对照2孔，空白对照1孔。

（4）加样　分别在相应孔中加入待测样品、阴、阳性对照50μL后，加酶结合物50μL，空白孔除外。充分混匀，用封板膜封板，置37℃水浴温育30 min。

（5）洗涤　小心将封板揭掉，用稀释洗涤液充分洗涤6次，每次均拍干（或用洗板机洗板）。

（6）显色　每孔加入底物A、B各50μL，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置37℃避光显色10 min，每孔加入50μL终止液，轻轻振荡混匀。

（7）测定A值　设定酶标仪单波长450 nm或双波长450/630 nm，读取各孔A值。

【结果判断】

（1）定性　P/N值：（待测样本A值-空白对照A值）/（阴性对照A值-空白对照A值）。一般以P/N≥2.1为阳性。

（2）定量　将已知浓度或活性单位的标准抗原或抗体，按适当比例稀释后在实验系统中进行反应，分别测定A值，以抗原或抗体水平为横坐标，以A值为纵坐标绘制标准曲线，根据检样的A值，由标准曲线获得其浓度或单位。

【注意事项】

（1）血清标本应新鲜、无溶血无污染。

（2）洗涤时各孔要加满洗涤液，勿使孔间交叉污染。

（3）试剂盒内所有物品及各种废弃物均按传染性物品处理。

（4）不同批号的试剂组分不得混用。

（5）由于试剂和技术操作上的原因，一次检测结果不能排除假阳性和假阴性的可能。同一份标本在不同实验室或采用不同的试剂盒可能会得出不一致的结果。因此结果有争议时，应进一步采用中和试验确认或进行HBV-DNA测定。

【临床意义】

HBsAg是HBV感染的特异性标志，阳性见于急性乙型肝炎的潜伏期或急性期、无症状HBsAg携带者，慢性乙型肝炎、HBV相关性肝硬化或肝癌。

3.间接法　间接法是检测抗体最常用的方法，其原理是利用固相化的特异性抗原将待测抗体固定，然后利用酶标记的抗抗体检测被固定的待测抗体。基本步骤如下。①包被抗原：用特异性抗原包被固相载体，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。②加待检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合的其他免疫球蛋白及血清中的杂质。③加酶标抗抗体：与固相复合物中的特异性抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗抗体复合物。④加底物显色：抗原-抗体-酶标抗抗体复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据显色反应程度对抗体进行定性或定量分析（图6-9）。

目前抗丙型肝炎病毒抗体采用此法检测。

图6-9　间接法原理示意

【原理】

于HCV抗原包被的微量反应板孔中，先后加入待测标本和酶标记抗抗体，若标本中含有抗-HCV，则形成固相抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物，加入底物显色，即可根据显色程度对抗体进行定性和定量分析。

【试剂与材料】

（1）抗-HCV诊断试剂盒。

（2）待测血清静　脉采血2 mL，离心分离血清备用。

（3）37℃水浴、酶标仪等。

【操作步骤】

（1）平衡　取出试剂盒置室温30 min以上。

（2）稀释洗涤液　浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释备用（稀释倍数根据具体试剂盒）。

（3）设置对照　每板应设阴性对照2孔，阳性对照2孔，空白对照1孔。

（4）加样　于阴性和阳性对照各孔中分别加入100μL阴、阳性对照血清；空白对照孔中加稀释液100μL。其余各孔加入100μL稀释液和10μL待测标本。轻轻振荡封板后，置37℃水浴30 min。

（5）洗涤　拍出孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置30s，扣去洗涤液，重复6次，最后一次在吸水纸上拍干（或用洗板机洗板）。

（6）加酶标记物　除空白对照孔外，每孔加入100μL酶标记物，轻轻振荡封板后，置37℃水浴20 min。

（7）洗涤　同步骤（5）。

（8）显色　每孔加底物液A、B各50μL，轻拍混匀后，置37℃水浴10min。每孔加终止液50μL，轻轻混匀。

（9）测定A值　设定酶标仪单波长450 nm或双波长450/630 nm，用空白孔校零，再读取各孔A值。

（10）计算临界值（CO）　CO= 0.12+阴性对照平均A值。

【结果判断】

待测样本A值≥CO为抗-HCV阳性；A值＜CO为阴性。

注：阴性对照应A值＜0.12，阳性对照应A值≥0.50。

【注意事项】

注意事项同“ELISA双位点一步法测定乙型肝炎病毒表面抗原”。

【临床意义】

抗-HCV阳性，常伴有HCV RNA的存在，因此抗-HCV是判断HCV感染的一个重要标志。

4.竞争法　竞争法一般用于抗原的检测。①包被抗体：用特异抗体包被固相载体，形成固相抗体，洗涤去除杂质。②加样：加受检标本和一定量酶标抗原，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则酶标抗原与受检标本中的抗原以同样的机会竞争结合固相抗体，洗涤去除杂质。同时设对照。③加底物显色：显色的程度与待测抗原的量呈负相关（图6-10）。

当抗原中的杂质难以去除或抗原的结合特异性不稳定时，可以采用竞争法测定抗体，如乙型肝炎病毒抗-HBe的测定。

图6-10　竞争法原理示意

【原理】

标本中的待测抗体和一定量的酶标抗体竞争结合固相抗原。标本中抗体含量愈多，结合在固相上的酶标抗体愈少，最后的显色也愈浅。

【试剂与材料】

（1）抗-HBe　诊断试剂盒。

（2）待测血清　静脉采血2 mL，离心分离血清备用。

（3）37℃水浴、酶标仪等。

【操作步骤】

（1）平衡　取出试剂盒置室温30 min以上。

（2）稀释洗涤液　浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释备用（稀释倍数根据具体试剂盒）。

（3）设置对照　每板应设阴性对照2孔，阳性对照2孔，空白对照1孔。

（4）加样　于阴性和阳性对照各孔中加入100μL阴、阳性对照血清；空白对照孔中加100μL稀释液，其余各孔加入100μL样本。除空白对照孔外，每孔加50μL中和试剂，轻轻振荡封板后，置37℃水浴90 min。

（5）洗涤　拍去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置30s，拍去洗涤液，重复4次后在吸水纸上拍干（或洗板机洗板）。

（6）加酶标记物　除空白对照孔外，每孔加100μL酶标记物，轻轻振荡封板后，置37℃水浴90 min。

（7）洗涤　同（5）。

（8）显色　每孔加底物液A、B各50μL，轻轻振荡封板后，置37℃水浴20min。每孔加终止液50μL，轻轻混匀。

（9）测定A值　设定酶标仪单波长450 nm，用空白孔校零后读取各孔A值。

（10）计算CO　CO=0.3×阴性对照平均A值。

【结果判断】

S（样本的A值）/CO＜1.0者为抗-HBe阳性（即S≤临界值）；S/CO＞1.0者为抗-HBe阴性（即S＞临界值）。

注：阴性对照孔A值大于1.5时，按1.5计算；小于1.5时，按实际值计算。

【注意事项】

注意事项同“ELISA双位点一步法测定乙型肝炎病毒表面抗原”。

【临床意义】

抗-HBe的出现是病情趋向好转的征象，但并不意味着传染性消失，尤其见于HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者。

5.捕获法　又称反向间接法，主要用于急性感染诊断时IgM抗体的测定。将抗-人IgM抗体吸附于固相载体上，待测标本中的IgM类抗体多被固相抗体捕获。加入特异性抗原与被固相抗体捕获的IgM类抗体结合，再加入抗原特异的酶标抗体，形成固相抗-人IgM-IgM-抗原-酶标抗体复合物。最终根据加底物后的显色程度确定待检IgM抗体的含量（图6-11）。

图6-11　捕获法原理示意