染色标本检查

三、染色标本检查

细菌经染色后可与周围环境形成鲜明对比，在普通光学显微镜下可清楚看到其形态与某些结构，还可根据染色不同对细菌进行分类。因此染色标本的检查在细菌鉴定中具有非常重要的意义。

(一)常用染料

用于细菌染色的染料，多为人工合成的含苯环的有机化合物或苯的衍生物，其苯环上带有色基与助色基。色基决定化合物的颜色特性，携带的色基越多颜色越深，将带有色基的苯环化合物称为色原。色原虽本身带色，但与被染物无亲和力而不能使被染物着色。助色基并不显色，但它能解离，赋予化合物电离特性，解离后的染料可以与被染物结合使之着色。助色基有的为碱性，有的为酸性，助色基解离后的带电情况决定染料的酸碱性。大部分染料为有机酸或碱类，不溶于水，易溶于有机溶剂，故通常将染料制成盐类使之易溶于水。常用的染色剂有以下几种:

1．碱性染料电离后带色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。细菌等电点在pH值2～5之间，在中性环境中多带负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合，故多用碱性染色剂染色。常用的有碱性复红、结晶紫、亚甲蓝(美蓝)等。

2．酸性染料电离后带色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。一般情况下细菌都带负电荷不易着色。若降低菌液的pH值使细菌带正电荷，则可被染色。酸性染料通常用来使胞浆染色，很少用于细菌的染色。常用的有伊红、刚果红、酸性复红等。

3．复合染料(中性染料)复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料(伊红美蓝)、姬姆萨染料(伊红天青)等。

(二)细菌染色程序

细菌染色基本程序为:涂片(干燥)→固定→染色(初染→媒染→脱色→复染)。

1．涂片涂片方法　根据标本性质不同而异。一般临床标本及细菌液体培养物可用灭菌接种环直接涂于洁净载玻片上;细菌固体培养物涂片时，先用灭菌接种环取生理盐水置于洁净载玻片中央或略偏右，再用接种环灭菌后挑取菌落或少许菌苔于生理盐水中研磨均匀成约1 cm²的薄层，置室温下自然干燥。

2．固定常用火焰加热法固定。将涂片干燥后的载玻片在火焰上匀速同方向通过3次。要求玻片温度不超过60℃，以玻片触及手背皮肤热而不觉烫为宜。其目的一是杀死细菌，使细菌蛋白质变性凝固，固定细胞结构;二是固定细菌，使细菌与玻片黏附牢固，防止染色过程中被冲掉;三是增加细菌对染料的通透性，易于着色。特殊固定法有冷冻干燥法和化学干燥法。

3．染色根据检验目的选择不同的染色剂。单染法只用一种染色剂，复染法选用两种或多种染色剂进行染色。染色时染液量以覆盖菌膜为宜，染色时间随染色方法　不同而定。

4．媒染有时对细胞和组织的染色仅用染料染色并不能着染，此时可使用某些物质使染料对被染物亲和力增加，使之易于着色。这类物质称为媒染剂，这一过程称为媒染。媒染剂可与染液同用、也可用于固定后初染前，还可用于染液后，这三种方法　分别称为同媒染、前媒染和后媒染。常用的媒染剂有石炭酸、碘液、鞣酸、明矾、酚等。

5．脱色能够使染料从被染色的细胞中脱色的物质称为脱色剂。用脱色剂使某些已着色的细菌脱去颜色，以显示各种细菌的不同染色反应性和结构特点。脱色剂种类繁多，乙醇是最常用的脱色剂，此外还有丙酮、盐酸酒精等。

6．复染经脱色处理后的细菌再滴加不同于初染液颜色的染液复染，而与初染液染色的物质形成鲜明对比，便于观察，用于细菌的鉴别。复染液颜色不宜过深，防止盖过初染液颜色。常用的有沙黄、亚甲蓝、稀释复红等。

(三)细菌常用染色方法　

1．单染法只用一种染色剂对细菌进行染色称为单染法，如用美蓝、石炭酸复红、结晶紫等。单染法主要用于细菌大小、形态、排列及简单结构的观察，不能观察细菌染色性。

2．复染法用两种或两种以上不同颜色的染色剂对不同细菌或同一细菌不同结构进行染色的方法　称为复染法。复染法既可以观察细菌的形态结构，又可以根据细菌及不同结构染色不同鉴别细菌。常用的有革兰染色和抗酸染色。

(1)革兰染色:革兰染色(Gram stain)于1884年由丹麦细菌学家Hans Christain Gram首创，是细菌学中应用　最经典最广泛的鉴别染色方法　。

染色方法　为:细菌涂片固定后，结晶紫染液初染1 min，水洗;卢戈碘液媒染1 min，水洗;95%乙醇脱色30 s～1 min，水洗;石炭酸复红或沙黄染液复染1 min，水洗吸干后镜检。

经革兰染色后，凡能抵抗乙醇脱色作用被染成紫色的细菌称革兰阳性菌(G⁺);不能抵抗乙醇脱色作用被复染成红色的细菌称革兰阴性菌(G－)。

革兰染色原理　尚未清楚，目前主要有细胞膜通透性学说、细菌等电点学说及化学结构学说。①细胞膜通透性学说:革兰阳性菌的细胞壁肽聚糖层数多，为三维立体网状结构，且95%乙醇使细胞壁脱水通透性降低，使得染料和碘的复合物不易被乙醇所溶出。而革兰阴性菌细胞壁的肽聚糖层数少，为疏松的二维网络状结构，脂质含量多，使得染料和碘的复合物易被乙醇所溶出。所以革兰阳性菌仍保持原来的紫色，而革兰阴性菌染成的紫色被酒精脱掉后复染成红色。②细菌等电点学说:革兰阳性菌的等电点在pH值2～3，革兰阴性菌的等电点在pH值4～5，在相同pH值环境中革兰阳性菌携带的负电荷比革兰阴性菌的多，和碱性染料的亲和力比革兰阴性菌强，故不易脱色。③化学结构学说:革兰阳性菌含有核糖核酸镁盐，易和结晶紫－碘复合物结合而不易被脱色。而革兰阴性菌含量少，故易被95%乙醇脱色。目前认为，革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁结构及化学成分不同为染色性差异的主要原因。

革兰染色的意义主要有三个方面。①有助于鉴别细菌:通过革兰染色可以将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类，便于进一步鉴定细菌;②指导临床用药:因革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁的差异，导致他们对抗菌药物的敏感性不同，临床绝大多数革兰阳性菌对青霉素类抗菌药物敏感，而革兰阴性菌(除脑膜炎奈瑟菌与淋病奈瑟菌外)因有外膜保护且无青霉素作用点而对青霉素类抗菌药物不敏感，对氯霉素、链霉素等敏感。所以临床感染标本可通过革兰染色结果选择适当药物进行治疗。③判断细菌致病性:一般革兰阳性菌致病物质多为外毒素，革兰阴性菌致病物质多为内毒素，其致病机制不同，故可通过革兰染色结果初步制定治疗方案。

(2)抗酸染色:抗酸染色(acid－faststain)于1882年由埃利希(F．Ehrlich)首创并经F．齐尔(Ziehl)改进。用于鉴别抗酸菌与非抗酸菌。

染色原理　:分枝杆菌属细胞壁含有大量脂质，主要为分枝菌酸，包绕于肽聚糖外，一般染色不易着色，经加温染色着色后分枝菌酸与染料结合紧密，不易被脱色剂脱色，故主要用于鉴定分枝杆菌属。分枝杆菌属抗酸染色为阳性。

染色方法　:细菌涂片干燥固定后，滴加石炭酸复红染液弱火加温染色5 min，注意勿煮沸或煮干，随时添加染液，水洗后滴加3%盐酸酒精脱色至无红色染液，水洗后滴加吕氏美蓝染液复染1 min，水洗吸干后镜检。

染色结果:抗酸菌被染成红色，非抗酸菌被染成蓝色。

(3)特殊染色:细菌的某些基本结构如细胞壁、细胞核、胞质颗粒，特殊结构如荚膜、鞭毛、芽胞等一般染色不易着色，需用特殊方法　染色才能观察。常用的特殊染色法有细胞壁染色、异染颗粒染色、荚膜染色、鞭毛染色、芽胞染色等。

细胞壁染色:细菌涂片干燥固定后，滴加100 g/L鞣酸染液染色15 min，水洗后滴加5 g/L结晶紫染液染色3～5 min，水洗后吸干镜检。镜下观，有细胞壁的细菌菌体周边染成紫色，菌体内无色;无细胞壁的细菌整个菌体呈紫色。

异染颗粒染色:细菌涂片干燥固定后，滴加Neisser染色液甲液染色3 min，水洗，滴加Neisser染色液乙液染色1 min，水洗后吸干镜检。镜下观菌体呈黄褐色，异染颗粒呈蓝黑色。

荚膜染色:细菌涂片干燥后，滴加结晶紫染液初染5～7 min，以20% CuSO₄溶液轻洗复染2次，吸干后镜检。镜下观菌体呈紫色，荚膜呈无色或浅蓝色。

注意因加热可使荚膜失水变形，同时细菌菌体收缩与周围染料脱离形成透明区，易被误认为荚膜，故荚膜染色时无须加热固定。另外荚膜为水溶性，故染色过程中不能水洗，且要以20% CuSO₄溶液脱色，复染时动作要轻柔。

鞭毛染色:取95%乙醇浸泡24 h以上的新载玻片，接种环沾取少许菌落于玻片上的蒸馏水滴顶端(一般只需点一下，只允许极少量细菌进入水滴)，使其自然流散成薄膜(不可用接种环搅动，以免鞭毛脱落)。玻片自然干燥后用改良Ryu法鞭毛染液染色10～15 min，用蒸馏水缓慢滴加在玻片上端无菌膜处冲去染液，玻片自然干燥后镜检。

芽胞染色:细菌涂片干燥固定后，滴加石炭酸复红染液初染，加热至染液出现蒸汽而不沸腾，持续5～10 min，水洗后滴加95%乙醇脱色约2 min，水洗后滴加碱性美蓝染液复染1 min，水洗后吸干镜检。镜下观菌体呈蓝色，芽胞呈红色。

负染色法:负染色法又称衬托染色法或间接染色法，是利用细菌菌体表面带有负电荷，不易与带有正电荷的酸性染料结合的特性，将背景着色而细菌不着色的方法　。负染色法中细菌无需加热固定，不会受染液等因素变形。常用的染液有刚果红、苯胺黑等。负染色法主要用于观察细菌大小、形态及不易着色的微生物，如螺旋体。例如墨汁复染配合美蓝染色观察肺炎链球菌荚膜，镜下观背景呈黑色，肺炎链球菌菌体呈蓝色，外面包绕一层无色透明的区域即为荚膜。

(乌仁高娃)　　

思考题

1．革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁的主要区别有哪些?

2．细菌细胞壁有哪些医学意义?

3．简述质粒的概念与特征。

4．简述细菌特殊结构的功能与意义。

5．简述细菌革兰染色法、染色结果和染色意义。

6．简述抗酸染色法及意义。

7．直接涂片检查能为临床提供哪些信息?哪些细菌的直接涂片检查有初步诊断价值?

8．某患者脓液标本直接涂片革兰染色镜检，镜下见菌体染成红色、短杆状、分散排列。该结果应如何报告?