毒素半定量检测过程

一、聚合酶链反应

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外的核酸扩增技术。其基本原理　是以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸链作为引物，以三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)为底物，通过耐热的DNA多聚酶酶促反应，通过变性－退火－延伸等几个步骤的重复多次循环，使目的DNA片段以指数形式得到扩增，使pg水平的核酸在短时间内达到ng水平量。再经琼脂糖电泳，可显示出一条特定的DNA区带，与对照比较可做出鉴定。PCR技术整个循环过程需在特殊的DNA扩增仪进行，仅需要几个小时，因此具有快速、敏感、特异和简便的优点。

PCR基本过程为如下环节。①变性:加热使模板DNA双链间的氢键断裂形成两条单链。②退火(复性):当温度降至一定程度(55℃左右)时，引物即与模板DNA单链的互补序列配对结合形成杂交链。③延伸:将反应混合物冷却至某一温度，在DNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核糖核苷底物和Mg²⁺存在的条件下，从引物的3'端开始结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。④循环:重复上述变性－退火－延伸的循环过程，每一循环获得的“新DNA链”都可成为下次循环的模板。经过30～40次循环所得到的特异性DNA扩增产物，数量可达到10⁶～10⁹，足以满足检测的需要。PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。

PCR的产物通常使用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶电泳分析PCR产物电泳，EB(溴化乙锭)染色后在紫外仪下观察，初步判断产物的特异性，PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用　多对引物，其产物片段都应符合预计的大小。还可通过酶切分析、分子杂交以及核酸序列分析等方法　进行PCR产物的检测。

对于目前传统培养方法　不能及时准确检出、敏感性太低或培养时间过长的病原体(如结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、沙眼衣原体、军团菌、肺炎支原体、立克次体)等，采用PCR检测可作出快速准确的鉴定。此外，PCR方法　在细菌的毒素检测方面也有广泛应用　，根据各毒素基因序列设计合成各自特异的引物，扩增特异的毒素基因片段。如霍乱肠毒素、ETEC产生的LT和ST、EHEC产生的vero毒素、艰难梭菌毒素、金黄色葡萄球菌产生的肠毒素、剥脱毒素和毒素休克综合征毒素等都可通过PCR进行其基因检测。