纸片琼脂扩散法

一、纸片琼脂扩散法

纸片琼脂扩散法又称Kirby－Bauer(K－B)法，由于其在抗菌药物的选择上具有灵活性，且花费低廉，被WHO推荐为定性药敏试验的基本方法　，已在临床广泛使用。

(一)原理　

将含有定量抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围扩散，形成递减浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈(图6－1)。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感性程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(M IC)呈负相关，即抑菌圈越大，M IC值越小。纸片扩散法的优点是结果直观和易于理解，但纸片扩散法无定量结果，在同是敏感和耐药的情况下不能确切反映程度上的差别。

图6－1　纸片扩散法药物敏感试验

(二)材料

1．培养基水解酪蛋白琼脂(Mueller－Hintonagar，MH)是生长较快的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验的标准培养基。琼脂平板厚度为4 mm，要求均匀一致，pH值7．2～7．4。用塑料袋密封后置于4℃冰箱保存l周。使用前应置于35℃孵育15～30 min，使其表面干燥。对营养要求较高的细菌(如淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌)进行药敏试验时，需加入相应的营养物质;测定耐甲氧西林葡萄球菌时应在MH琼脂中加入2%～4% NaCl。

2．抗菌药物纸片目前已将用于琼脂扩散的纸片标准化，各种药敏纸片均有商品供应。选择直径为6．35 mm，吸水量为20μL的专用药敏纸片，用逐片加样或浸泡方法　使每片含药量达到规定浓度。冷冻干燥后密封，于－20℃以下保存备用。需反复工作用纸片应密封储存4℃冷藏，不超过1个月。有些不稳定的抗菌药物(如碳青霉烯类、加克拉维酸的β－内酰胺类复合制剂等)需冷冻保存。盛纸片的小瓶使用前应移至室温平衡1～2 h，以避免开启后出现冷凝水使纸片潮解。

3．标准比浊管为保证敏感试验的准确度和精密度，必须对接种菌液的浓度做相应控制。使用0．5麦氏标准比浊管，标定接种菌液浓度。比浊管配制方法　:取0．048 mol/L的氯化钡(1．175% BaCl₂·H₂O)0．5 mL，加到995 mL的0．18 mol/L硫酸(1%)溶液中并不断搅动以维持混悬状态，制成比浊管。选管径与制备菌液试管相同的螺口试管，每管分装4～6 mL，置于室温暗处保存。在使用前，应将比浊管充分混匀。有效期为6个月。

(三)试验步骤

1．制备菌液　挑取经过35℃16～24 h孵育的纯培养物，制备菌悬液(也可采用细菌液体生长法)，将菌液调正至0．5麦氏浊度单位。制备好的菌液需在15 min内使用。

2．涂布接种　用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，挤出过多的菌液，然后在M－H平板表面反复均匀涂抹3次，每涂一次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂两圈，保证涂布均匀。涂布完毕后，置室温3～5 min。

3．贴药敏纸片　用无菌镊子或纸片分配器将纸片贴于平板表面，并确保纸片与平板表面完全接触;各纸片中心距离不小于24 mm，通常一个直径90 mm的平板可贴6～7个纸片。纸片一但贴上，药物会立即扩散，因此纸片贴好后不能再移动。

4．孵育　置35℃孵育16～18 h判读结果。葡萄球菌测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素时需24 h，肠球菌测万古霉素需24 h。不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜麦芽窄食单胞菌(35±2)℃孵育20～24 h。

(四)结果判读和报告

用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径。先测量质控株的抑菌圈直径，以判断质控是否合格，然后量取待测菌株的抑菌圈直径。根据美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)的最新解释标准，将量取的抑菌圈作出敏感、中介或耐药的判断(表6－3)。

敏感(S)指受试菌株能被测定药物常规剂量给药后在感染部位所达到的浓度所抑制或杀灭;中介(I)指抗菌药物M IC接近血液和组织中通常可达到的浓度，疗效低于敏感菌，还表示药物在生理浓集的部位具有临床效力(如尿液中的喹诺酮类和β－内酰胺类)或者可用高于正常剂量的药物进行治疗(如β－内酰胺类)，中介还作为缓冲区，以防止微小的、未受控制的技术因素导致较大的错误结果，特别是对那些药物毒性范围靠近疗效范围的药物;耐药(R)指受试菌株不能被常规剂量抗菌药物达到的浓度所抑制，临床治疗无效。

表6－3　部分药物纸片扩散法及稀释法结果解释标准(CLSI)

续表6－3

续表6－3

(五)影响因素

1．培养基　培养基的成分、pH值、厚度、琼脂浓度等因素均会影响抑菌环直径的大小，培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质。

2．菌量　菌悬液浓度要合适，浓度偏高会导致抑菌环缩小，浓度偏低会导致抑菌环扩大。因此要正确配制、使用和保存麦氏比浊标准管。

3．纸片含药量　纸片含药量是影响纸片扩散法药敏试验结果的重要因素之一。根据试验，纸片含药量低于规定标量的50%时，则对抑菌圈直径影响较大。药敏纸片应注意保存在干燥环境，若保存不当可使药效下降，抑菌圈缩小。纸片只能在有效期内使用。

4．操作方法　试验过程中的孵育条件、温度和时间以及抑菌圈测量工具的精确度等都会直接影响药敏结果。

5．质控因素　质控菌株本身的药敏特性是否合格，有无变异等都将影响药敏试验的结果。

(六)质量控制

1．质控菌株　纸片琼脂扩散法药敏试验常用的质控菌株包括金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212、大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218和铜绿假单胞菌ATCC27853等。标准菌株应从国家菌种保藏中心购置。标准菌株应每周在MH琼脂上传代一次，4℃保存。由于质控菌株的抑菌圈较大，因此在直径90 mm的平板上贴不超过4个纸片为宜。

2．质控方法　常规工作中应按要求进行质量控制，每次药敏试验应将标准菌株和待测菌在同一条件下做药敏试验，测定质控菌株的抑菌环，以便对照检测每日标准菌株的测定结果。应以抑菌环直径为纵坐标，天数为横坐标绘制室内质控图，日间质控得到的抑菌环直径在连续20个数值中仅允许1个超出规定的范围。质控菌株的抑菌圈直径应在CLSI允许的预期范围内，要求每日标准菌株的测定结果的均值应接近允许范围的中间值，变化数值不超过2 mm。