真菌的培养技术

二、真菌的培养技术

(一)培养基

真菌的营养要求不高，最适pH值4．0～6．0。在一般细菌培养基上即可生长。在不同的培养基上真菌菌落形态变化很大，一般以沙保弱培养基为基准，描写菌落的形态。常用的真菌培养基见24－1。

表24－1　常用真菌培养基及用途

(二)培养方法　

1．试管培养　培养基置于试管中培养，是临床上最常用的培养方法　之一，主要用于临床标本分离的初代培养和菌种保存。

2．大培养　将培养物接种在培养皿或特制的培养瓶内，主要用于纯菌种的培养和研究。

3．小培养　主要用于菌种鉴定，小培养分为玻片法，方块法和钢圈法。

(1)玻片法:在消毒的载玻片上，均匀地浇上熔化的培养基，不宜太厚。凝固后接种待鉴定菌株，置于平皿中，保湿。待有生长后，盖上消毒的盖玻片，显微镜下直接观察，常用玉米粉吐温琼脂培养基观察白色念珠菌的顶端厚壁孢子和假菌丝。

(2)方块法:适用于霉菌菌落的培养。取无菌平皿倒入约15 mL熔化的培养基，待凝固后用无菌小铲或接种刀划成1 cm²大小的小块。取一小块移在无菌载玻片上，然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株，盖上消毒的盖玻片，放入无菌平皿中的V形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，并加入少量无菌蒸馏水，孵育，待菌落生长后直接将载玻片置显微镜下观察。

(3)钢圈法:先将固体石蜡加热熔化，取直径约2 cm，厚度约0．5 cm的有孔口的不锈钢小钢圈，火焰消毒后趁热浸入石蜡油，旋即取出冷却，石蜡油即附着于小钢圈中。再取一无菌载玻片，火焰上稍加热，将小钢圈平置其上，孔口向上。小钢圈上石蜡油遇载玻片的热即熔化后凝固，钢圈就会固定在载玻片上。用无菌注射器经孔口注入熔化的培养基，培养基量约占小钢圈容量的1/2，注意避免气泡。待培养基凝固后，取一消毒盖玻片火焰上加热后，趁热盖在小钢圈表面，即固定其上。最后用接种针伸入孔口进行接种。这种方法　的优点是形成一种封闭式培养，在显微镜下直接观察菌落时可避免孢子吸入人体，而且不易被污染，盖玻片也可取下染色后封固制片保存。

(三)培养结果的观察

1．观察方法　标本接种后，每周至少检查2次，观察生长速度、菌落大小、表面形态、菌落颜色、菌落边缘、菌落底部等。

(1)生长速度:7～14 d者为缓慢生长菌;2～7 d者为快速生长菌。一般浅部真菌生长周期超过2周，深部真菌超过4周仍无生长，可报告阴性。

(2)菌落颜色:不同的菌种表现出不同的颜色，呈鲜艳或暗淡。致病性真菌的颜色多较淡，呈白色或淡黄色，而且其培养基也可变色，如马尔尼菲青霉等，有些真菌菌落不但正面有颜色，其背面也有深浅不同的颜色。菌落的颜色与培养基的种类、培养温度、培养时间、移种代数等因素有关。所以，菌落的颜色虽在菌种鉴定上有重要的参考价值，但除少数菌种外，一般不作为鉴定的重要依据。

(3)培养物镜检:小培养可置普通显微镜下直接观察，而试管和平皿培养的菌落则需挑起后做涂片检查。

2．菌落类型①酵母型菌落:外观光滑、质地柔软、呈乳酪样，与细菌菌落相似，如隐球菌。②酵母样型菌落:与酵母型菌落相似，但形成假菌丝，伸入培养基中，如白念珠菌。③丝状菌落:是多细胞真菌的菌落形态，呈棉絮状、绒毛状或粉末状。