实验十四 中性粒细胞碱性磷酸酶染色
Neutrophilic alkaline phosphatase staining，NAP
一、实验目的
掌握中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理和临床意义，能正确判断中性粒细胞碱性磷酸酶染色的结果，能操作中性粒细胞碱性磷酸酶染色，知道中性粒细胞碱性磷酸酶染色注意事项。
〔改良Gomori氏钙钴法〕
二、实验原理
中性粒细胞内的碱性磷酸酶（NAP）在碱性环境中，可水解β‐甘油磷酸钠，释放的磷酸根离子与钙离子作用而生成磷酸钙沉淀，与硝酸钴作用后生成磷酸钴，最后与硫化铵作用生成黑色稳定的硫化钴颗粒，而定位于胞质中。
三、实验器材
新鲜骨髓片或血片、显微镜、37℃水浴箱、擦镜纸。
四、实验试剂
1.95％乙醇。
2.基质液：20g／L巴比妥钠10ml、20g／L MgSO42ml、30g／L甘油磷酸钠10ml、20g／L CaCl220ml、蒸馏水20ml，混合而成。
3.20g／L硝酸钴溶液。
4.硫化铵溶液：硫化铵1～2ml加蒸馏水至100ml。
5.5g／L伊红溶液。
五、实验方法
1.新鲜、干燥骨髓片或血片用95％乙醇固定5～10min，水洗。
2.将涂片浸于基质液中，37℃水浴4h，水洗。
3.浸入20g／L硝酸钴溶液5min，水洗。
4.浸入硫化铵溶液中5min，水洗。
5.5g／L伊红水溶液复染5min。
6.水洗，待干，油镜镜检。
7.结果判断（见彩图2‐8）：胞浆中出现浅灰色或棕黑色或黑色沉淀为阳性。
阳性程度判断标准如下：
0分（－）：胞浆无灰黑色成分。
1分（＋）：胞浆呈浅灰色或棕黑色沉淀，不超过胞浆总面积1／4。
2分（＋＋）：胞浆呈均匀棕色或棕黑色沉淀，占胞浆总面积的1／2。
3分（＋＋＋）：胞浆内充满黑色颗粒，但颗粒间尚有空隙。
4分（＋＋＋＋）：胞浆内充满黑色颗粒，而且沉淀掩盖到核上。
8.结果报告：报告阳性率和积分值。阳性率：计数100个成熟中性粒细胞（分叶和杆状核粒细胞），求得阳性细胞百分率。计算积分值：将所有阳性反应的细胞均换算为1分（＋）强度后的总和。
六、注意事项
1.涂片要及时固定染色，若不能及时测定，可固定干燥后放冰箱4～8℃保存。
2.基质液应临用前配制，配制后的β‐甘油磷酸钠溶液不宜久放，否则β‐甘油磷酸钠易水解，浓度降低。
3.每次染色时，最好同时做1份细菌感染患者的血片为阳性对照，以增加结果的可靠性。
4.硫化胺试剂为淡黄色，若变深黄色，应及时更换。
七、结果报告
八、临床意义
NAP是临床上一个重要的细胞化学染色，主要用于下列几组疾病的鉴别：①反应性组织细胞增多与恶性组织细胞病。②类白血病反应与慢性粒细胞性白血病。③细菌性感染与病毒性感染。④急性淋巴细胞性白血病与急性髓细胞性白血病。⑤再生障碍性贫血与阵发性睡眠性血红蛋白尿。每组疾病中，前者病情程度、预后及治疗反应相对较好，积分较高，而后者积分减低。另外，使用皮质激素时，NAP活性也可增高。
〔卡氏偶氮偶联法〕
一、实验原理
中性粒细胞胞质内的碱性磷酸酶在碱性条件下，能水解磷酸萘酚钠，释放出的萘酚与重氮盐（坚牢蓝RR）作用生成不溶性的有色沉淀，定位于胞质中。
二、实验器材
骨髓片或血片、显微镜、擦镜纸。
三、实验试剂
1.固定剂：10％甲醛‐甲醇固定液：甲醛1份与甲醇9份混合，4℃保存。
2.丙二醇缓冲液：①贮备液（0.2mol／L）：2‐氨基‐2‐甲基‐1，3‐丙二醇10.5g，蒸馏水加至500ml。②应用液（0.05mol／L pH9.7）：0.2mol／L贮备液25ml，0.1mol／L盐酸5ml，蒸馏水加至100ml。
3.基质液（pH9.5～9.6）：α‐磷酸萘酚钠20mg溶于0.05mol／L丙二醇缓冲液20ml，再加坚牢蓝RR（或坚牢紫酱）20mg，混合后用滤纸过滤。此试剂用前临时配制。
4.①苏木素染液：苏木素1g加500ml蒸馏水，加热溶解，再加500ml蒸馏水、碘酸钠200g、硫酸铝钾50g，充分混匀，置棕色瓶保存。②1％美蓝水溶液。
四、实验方法
1.新鲜血片或骨髓片用4～8℃的固定剂固定30s。
2.涂片在基质液中室温下作用10～15min，水洗。
3.苏木素染液复染1～2min或1％美蓝1～2min。
4.水洗，待干，镜检。
5.结果判断：胞浆中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性（重氮盐用坚牢蓝RR为紫黑色，用坚牢紫酱为棕红色）。阳性程度判断标准如下：
0分（－）：胞浆中无阳性颗粒。
1分（＋）：胞浆中含少量颗粒或呈弥漫红色。
2分（＋＋）：胞浆中有中等量颗粒或弥漫红色。
3分（＋＋＋）：胞浆中有丰富的颗粒或弥漫较深红色。
4分（＋＋＋＋）：胞浆中有极丰富的大颗粒或弥漫深红色。
6.结果报告：报告阳性率和积分值。
五、注意事项
1.基质液须临用前新鲜配制，一般在血片或骨髓片固定后，才开始配制。
2.α‐磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多，应根据基质液选择相适应的重氮盐。
六、结果报告
七、临床意义
见改良Gomori氏钙钴法。
【目标检测】
一、单选题
1.鉴别急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病首选的化学染色是 （ ）
A.PAS染色 B.NAP染色 C.POX染色 D.铁染色
E.NAS‐DCE染色
2.POX染色呈阴性的细胞为 （ ）
A.嗜酸性粒细胞 B.中性分叶核粒细胞 C.淋巴细胞 D.单核细胞
E.早幼粒细胞
3.患者，女，32岁，半年来头晕、乏力。化验：红细胞3.0×1012／L，血红蛋白60g／L，白细胞4.0×109／L，血小板152.0×109／L，网织红细胞1.8％，小细胞低色素贫血，MCV70fl，MCH24pg，MCHC300g／L，RDW17.5％。骨髓检查有核细胞增生明显活跃，红细胞系增生，以中、晚幼红细胞为主，幼红细胞胞质少，色偏蓝。现欲做细胞化学染色，需选择下列哪一项 （ ）
A.PAS染色 B.NAP染色 C.POX染色 D.铁染色
E.NAS‐DCE染色
4.找出下列错误的一项 （ ）
A.正常人骨髓细胞外铁为＋～＋＋
B.骨髓铁染色是利用普鲁士蓝反应原理
C.细胞外铁反映骨髓中可利用铁的量
D.铁染色可用于鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血
E.铁粒幼细胞性贫血时环形铁粒幼红细胞增多
5.区别红白血病和巨幼红细胞贫血首选 （ ）
A.PAS染色 B.NAP染色 C.POX染色 D.铁染色
E.NAS‐DCE染色
6.鉴别急性非淋巴细胞性白血病M1和M5常选用 （ ）
A.PAS染色 B.NAP染色 C.POX染色 D.铁染色
E.NAS‐DCE染色
7.鉴别慢性粒细胞性白血病和类白血病常选用 （ ）
A.PAS染色 B.NAP染色 C.POX染色 D.铁染色
E.NAS‐DCE染色
二、名词解释
1.环形铁粒幼红细胞
2.过碘酸‐雪夫反应
三、简述题
1.简述四甲基联苯胺法过氧化物酶染色的原理和临床意义。
2.简述酯酶染色的临床意义。
3.简述NAP染色的临床意义。
四、参考答案
（一）单选题
1.C 2.C 3.D 4.C 5.A 6.E 7.B
（二）名词解释
1.环形铁粒幼红细胞：若环核排列的铁粒5个以上或铁粒排列在核周1／3以上的幼红细胞称环形铁粒幼红细胞。
2.过碘酸‐雪夫反应：过碘酸‐雪夫反应又称糖原染色，细胞内含有乙二醇基的多糖类，被过碘酸氧化产生醛基，此醛基与雪夫氏试剂（Schiff’s液）作用，使无色的品红变成紫红色染料，而沉积于含有多糖类的细胞内。
（三）简述题
1.四甲基联苯胺法过氧化物酶染色的原理：粒细胞和单核细胞胞浆内含过氧化物酶（per‐oxidase，POX），能催化过氧化氢而释放新生氧，使四甲基联苯胺（TMB）氧化，生成四甲基联苯氨蓝，再与亚硝基铁氰化钠结合成稳定的蓝色颗粒而沉淀于细胞胞质内。
四甲基联苯胺法过氧化物酶染色的临床意义：①粒细胞系统：原始粒细胞呈阴性或阳性（分化差的原始粒细胞呈阴性，分化好的原始粒细胞呈阳性），早幼粒细胞及以后幼稚粒细胞均呈阳性，并随细胞发育成熟，阳性反应程度递增。成熟的中性粒细胞中含丰富均匀细小的阳性颗粒，嗜酸性粒细胞中颗粒粗大呈深蓝色，嗜碱性粒细胞呈阴性。②单核细胞系统：除部分原始细胞外，皆呈弱阳性反应，其颗粒细小稀疏。③某些组织细胞及吞噬细胞可呈不同程度的阳性反应。④所有淋巴细胞过氧化物酶染色皆为阴性。⑤该化学染色是区别急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病（M1～M5）的主要细胞化学染色，FAB分型规定前者阳性率＜3％。
2.酯酶染色的临床意义
（1）氯乙酸AS‐D萘酚酯酶染色的临床意义：帮助鉴别急性白血病的类型。急性粒细胞白血病时大多数白血病性原始粒细胞可出现阳性反应；急性早幼粒细胞白血病时异常的早幼粒细胞呈强阳性反应；急性单核细胞白血病时绝大多数的原始单核及幼稚细胞呈阴性反应，个别可呈弱阳性反应；急性粒‐单核细胞白血病时原始粒细胞和早幼粒细胞呈阳性反应，原始单核及幼稚细胞呈阴性反应；急性淋巴细胞白血病和急性巨核细胞白血病时白血病性淋巴细胞和巨核细胞均呈阴性反应。
（2）α‐醋酸萘酚酯酶染色的临床意义：单核细胞和组织细胞呈强阳性，但可被氟化钠抑制；巨核细胞及血小板呈阳性；早幼粒细胞白血病时早幼粒细胞可阳性，且不受氟化钠抑制。粒细胞、淋巴细胞一般为阴性，若有弱阳性也可被氟化钠抑制。临床鉴别：主要用于鉴别急性单核细胞性白血病与急性粒细胞性白血病，前者NSE阳性，且受氟化钠（NaF）抑制或部分抑制；而后者多数为阴性，若有阳性也不受氟化钠抑制。
3.NAP染色的临床意义：NAP是临床上一个重要的细胞化学染色，主要用于下列几组疾病的鉴别：①反应性组织细胞增多与恶性组织细胞病。②类白血病反应与慢性粒细胞性白血病。③细菌性感染与病毒性感染。④急性淋巴细胞性白血病与急性髓细胞性白血病。⑤再生障碍性贫血与阵发性睡眠性血红蛋白尿。每组疾病中，前者病情程度、预后及治疗反应相对较好，积分较高，而后者积分减低。另外，使用皮质激素时，NAP活性也可增高。
（吕霞飞）
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