实验十九 高铁血红蛋白还原试验
Methemoglobin reduction test
一、实验目的
掌握高铁血红蛋白还原试验（MHb‐RT）的原理、操作方法及临床意义。
二、实验原理
本实验是在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，通过测定高铁血红蛋白的还原速度间接反映葡萄糖‐6‐磷酸脱氢酶（G6PD）的活性。当红细胞内葡萄糖‐6‐磷酸脱氢酶含量正常时，通过戊糖循环形成的还原型辅酶Ⅱ可作为血液中高铁血红蛋白还原酶的辅酶，并在递氢体美蓝的参与下，使形成的高铁血红蛋白还原为亚铁血红蛋白。当红细胞内缺少葡萄糖‐6‐磷酸脱氢酶时，则高铁血红蛋白不能被还原。高铁血红蛋白为暗灰色，在630～650nm波长处吸光度最高，故可加以测定。
三、实验器材
采血用具、试管、吸管、试管架、离心机、分光光度计等。
四、实验试剂
1.0.18mol／L亚硝酸钠（含5％葡萄糖）溶液：亚硝酸钠1.25g，葡萄糖5g，加蒸馏水至100ml。置棕色瓶内，4℃保存。
2.0.4mmol／L亚甲蓝溶液：取亚甲蓝15mg（含3个结晶水），加少量蒸馏水研磨后用蒸馏水溶至100ml。
3.0.02mol／L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：称取磷酸氢二钠229.5mg，磷酸氢二钾52.2mg，加蒸馏水溶至100ml。
4.反应液：0.18mol／L亚硝酸钠（含5％葡萄糖）溶液1份加0.4mmol／L亚甲蓝溶液1份，充分混合。
5.0.109mol／L枸橼酸钠溶液。
五、实验方法
1.静脉取血1.8ml，加于含有0.109mol／L枸橼酸钠溶液0.2ml的小试管内，混合，加葡萄糖20mg，混匀。
2.将此标本1000r／min离心5min或放置4℃冰箱过夜，待红细胞下沉后吸去部分血浆，使红细胞与血浆比例约为1∶1（相当红细胞比容35％～40％）。
3.摇匀后吸取1ml血液，加反应液0.1ml，颠倒混合15次，使与空气中的氧气充分接触，加塞，置于37℃水浴（或保温箱）3h。同时将剩余未加反应液的血标本同样置于37℃水浴（或保温箱）3h。
4.取出后摇匀，吸取0.1ml，加于0.02mol／L磷酸盐缓冲液10ml中，混匀，2min后于波长635nm处比色，测其吸光度为SA。
5.吸取未加反应液但同样保温的血液0.1ml，加于0.02mol／L磷酸盐缓冲液10ml中，2min后按上法进行比色，测其吸光度为B，再于此液内加12.5g／L亚硝酸钠‐葡萄糖溶液1滴，摇匀，5min后用同样方法测其吸光度为ST。
六、结果计算
高铁血红蛋白还原率（％）＝
× 100％
式中，SA－B：还原后高铁血红蛋白的吸光度；
ST－B：还原前高铁血红蛋白的吸光度。
七、注意事项
1.血细胞比容值过低，高铁血红蛋白还原率降低。应将血细胞比容调整在0.35～0.40。
2.细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等应保持无菌。
3.不稳定血红蛋白、HbH、高脂血症等均可出现假阳性结果。可离心用上清液比色，减少影响。
4.标本中不应有凝血或溶血，以免影响测定结果。
5.抗凝剂应选用枸橼酸钠或ACD液，标本可保持1周左右。ACD用量不宜太多，会降低pH值使高铁血红蛋白还原速度减慢，出现假阳性。
6.分光光度计波长应准确，一般要求ST管应大于B管的8倍以上。
八、结果报告
记录各管比色时的吸光度并报告结果。
九、参考范围
正常人高铁血红蛋白还原率≥75％；脐血高铁血红蛋白还原率≥77％。
十、临床意义
蚕豆病和伯氨喹啉等药物溶血性贫血患者，高铁血红蛋白还原率可显著下降。葡萄糖‐6‐磷酸脱氢酶（glucose‐6‐phosphate dehydrogenase，G6PD）中间缺乏值（杂合子）还原率在31％～74％之间，脐血为41％～76％；纯合子型常在30％以下，脐血小于40％。
（沈 颖）
病例四
患者，林某，男36岁，因尿色深黄半月，伴头晕乏力10天入院。患者半月前无明显诱因下出现尿色深黄至浓茶颜色，且尿量明显减少，大量服用开水均无改变，尿色有时呈酱油色，近10天加重，且伴头晕乏力心悸，面色苍白，关节酸痛，无发热，无关节红肿。病来胃纳差，食欲不佳，睡眠不佳。偶有腰酸腰痛，但无尿频尿急尿痛。近半年来有肘关节酸痛，休息后有好转。体格检查：体温37.5℃，呼吸22次／分，脉搏92次／分，血压130／70mmHg，神清，发育正常，面色唇色苍白，中度贫血貌，皮肤无瘀点瘀斑，浅表淋巴结无肿大。巩膜轻度黄染，颈软，颈静脉无怒张，甲状腺无肿大，胸骨无压痛，心肺听诊无殊。腹软，无压痛，肝脾肋下未及。双肾区无叩痛。四肢关节无红肿，双下肢无浮肿。
实验室检查：红细胞1.20×1012／L，血红蛋白74g／L，白细胞11.9×109／L，分类正常，血小板213×109／L，网织红细胞16％，网织红细胞数量351×109／L［正常（19～89）×109／L］。尿常规：红细胞阴性，蛋白（＋＋），尿胆原（＋＋），胆红素阴性，白细胞阴性。大便常规阴性。血总胆红素65.9μmol／L，直接胆红素21.1μmol／L，间接胆红素44.8μmol／L。血钠、血钾、AST均在正常范围。血红蛋白电泳无殊。蔗糖试验阳性。直接抗人球蛋白试验1∶10（＋＋＋）。酸溶血试验阴性。血清铁蛋白840μg／L。抗核抗体阳性。腹部B超无殊。骨髓象：增生性贫血骨髓象。（见彩图3‐8）
答题要求：写出诊断及诊断依据。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
