实验二十 抗人球蛋白试验
Anti human globulin test
一、实验目的
掌握抗人球蛋白试验的原理、操作方法及临床意义。
二、实验原理
抗人球蛋白试验，又称Coombs试验，是诊断自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemo‐lytic anemia，AIHA）自身抗体（IgG）的重要依据。其分为直接和间接两种：免疫性溶血贫血直接试验是检查被检红细胞上有无不完全抗体，间接试验是检查血清中游离的不完全抗体。在AIHA的患者中温抗体溶血的自身抗体为IgG，此抗体能与表面附有相应抗原的红细胞结合，使红细胞致敏而不发生凝集，待加入抗人球蛋白血清后，则与红细胞上黏附的IgG相结合，使红细胞串并在一起而发生凝集，此即为直接抗人球蛋白试验（direct antiglobulin test，DAGT）。患者血清中存在游离的自身抗体，则可用Rh（D）阳性的O型红细胞加以吸附，再用已吸附有自身抗体的红细胞与AHGS作用而发生凝集反应，此即为间接抗人球蛋白试验（indirect antiglobulin test，IAGT）。
三、实验器材
采血用具、试管、吸管、水浴箱、离心机等。
四、实验试剂
1.受检者红细胞。
2.正常Rh阳性O型混合压积红细胞，阳性对照压积红细胞。
3.抗人球蛋白血清。
4.抗D（RHO）血清。
5.受检者血清。
6.AB型血清。
7.9g／L NaCl溶液。
五、实验方法
1.直接抗人球蛋白试验
（1）压积红细胞制备：取受检者抗凝血2ml，离心去血浆，用大量9g／L NaCl溶液洗涤3次，离心得压积红细胞。
（2）阳性、阴性对照红细胞悬液的制备：见表3‐2所示。
表3‐2 各类红细胞悬液的制备
以上各管混匀置37℃水浴中1h，离心去上清液，用9g／L NaCl 溶液洗涤3次，取红细胞加生理盐水配成10％的红细胞悬液。
（3）取小试管4支，按表3‐３操作。
表3‐3 抗人球蛋白直接试验操作方法
（4）混匀后，置室温5min（或1000r／min，离心1min），轻轻混匀后观察结果。
2.间接实验
（1）受检标本制备：取受检者抗凝血和凝集血，分别制备受检者的压积红细胞和血清。（2）按表3‐4操作。
表3‐4 抗人球蛋白间接试验操作方法
（3）以上各管混匀置37℃水浴中1h，用9g／L NaCl溶液洗涤3次，离心去上清液，每管仅剩1滴红细胞悬液。
（4）1～3管加抗人球蛋白血清1滴，4管加9g／L NaCl溶液1滴，混匀后，室温下5min（或1000r／min，离心1min）后，轻轻混匀后观察结果。
六、注意事项
1.本实验必须设阳性对照、阴性对照、盐水对照。若阳性对照不凝集，说明抗D血清失效或抗人球蛋白血清失效，应更换试剂；若阴性对照出现凝集，可能由于抗人球蛋白血清中含有残余种属抗体，或被污染；若盐水对照出现凝集，可能存在完全抗体或其他原因导致的自凝现象，则本实验失去意义，不能判断结果。
2.红细胞应迅速、充分洗涤，除去吸附的血浆球蛋白，以免中和抗人球蛋白出现假阴性。并切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防来自皮肤的蛋白中和抗人球蛋白出现假阴性。
3.尽量用温和的9g／L NaCl溶液进行实验，以利于消除高浓度冷抗体的影响，避免假阳性。
4.血液标本要当天检查，不宜久置过夜，否则会使反应减弱。
5.用枸橼酸钠、EDTA或肝素抗凝对强抗体无明显影响，对弱抗体有抑制作用，因此用去纤维蛋白抗凝方法最好。
6.如需要了解在体内致敏红细胞的Ig类型，则可分别以抗IgG、IgM、C3单价抗人球蛋白血清进行实验。
七、结果判断
1.直接实验：如阴性对照不出现凝集，而阳性对照及被检红细胞出现凝集，即阳性结果，表示被检红细胞膜上有不完全抗体。无凝集者为阴性。
2.间接实验：若对照完全相符，再看待检管结果，若出现凝集为阳性，提示待检血清中有不完全抗体，则该实验阳性；无凝集为阴性，则表示待检血清中无不完全抗体，则该实验阴性。
八、结果报告
记录各管红细胞凝集情况。
九、参考范围
健康人直接实验和间接实验均呈阴性。
十、临床意义
自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、新生儿同种免疫性溶血、阵发性冷性血红蛋白尿症、药物性免疫性溶血等直接抗人球蛋白实验呈阳性，当抗体与红细胞结合后，有过剩抗体时直接和间接实验均为阳性。
1.正常人抗人球蛋白试验直接、间接试验均呈阴性。
2.温抗体型自身免疫性溶血性贫血、新生儿同种免疫溶血病常呈直接试验阳性反应。
3.自身免疫性溶血性贫血大多属于温抗体型（主要为IgG），但也有小部分属于冷抗体型（主要为IgM）。故必要时应于4℃条件下进行试验以检出其冷抗体，否则会导致假阴性反应。
4.由于病人不完全抗体的性质不同，含量不一，以及所用抗血清效价的影响，本试验的检出阳性率也不一致，故除用多价的抗人球蛋白血清进行试验外，必要时需加用单价抗血清，以提出检出阳性率。
5.间接抗人球蛋白试验主要检测病人血清中是否有不完全抗体，常用于Rh或ABO型新生儿同种免疫溶血病的母体血清中不完全抗体的检测。因其敏感性差，很少用于AI‐HA的诊断。
6.本试验阳性还可见于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、淋巴瘤、恶性肿瘤、甲基多巴及青霉素型药物诱发性免疫性溶血性贫血等。
7.本试验较易发生假阴性反应。下列情况易发生假阴性反应：①试剂不适宜；②自身抗体的解离常数高；③红细胞上所吸附的抗体浓度过低；④发病早期即已大量应用肾上腺皮质激素。
附：病例解析答案
自身免疫性溶血性贫血（AIHA）。患者红细胞大量被破坏：巩膜黄染，中度贫血貌，红细胞明显减少，尿胆原阳性，间接胆红素升高，骨髓象显示为增生性贫血骨髓象。同时，患者红细胞代偿性增生：网织红细胞比例明显升高。抗人球蛋白试验和蔗糖试验均为阳性也是诊断本病的重要证据。
（沈 颖）
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