尿液蛋白分析

第四节　尿液蛋白分析

持续蛋白尿是肾脏损害的一个重要标志。对尿蛋白做进一步的分析，不仅包括定量，还要对其性质做进一步的分析，以鉴别这些蛋白的来源，对于肾脏疾病的定位诊断是非常重要的，对某些微量蛋白的检测还可以发现一些疾病的早期信号。

一、尿蛋白的定性分析

大多患者是通过该实验首先获得尿中存在蛋白的，包括定期的体检。定性实验不能确定蛋白量的多少和蛋白的性质，所以它只是一个过筛检查。

（一）试纸法

本法快速、简捷，基本能反映尿中蛋白的量，但容易受到干扰物的影响，使结果偏离，甚至造成假阳性或假阴性。详见尿常规中干化学法。

（二）加热醋酸法

是利用加热使蛋白质变性凝固，再加酸使尿液pH下降达到等电点（pH4．7），使蛋白质完全沉淀，同时可以消除尿中某些磷酸盐加热析出所致的浑浊。本法干扰因素少，结果可靠，为目前蛋白定性检验中最可信的方法。

1．方法

用150×150mm的试管，加入尿液至2/3高度，加热煮沸，看有无浑浊，然后加5%醋酸3～4滴，再煮沸，观察有无浑浊和沉淀。正常为阴性，无浑浊，否则为阳性。

2．评价

本方法较敏感，敏感性为150mg/L，而且干扰因素少。但加热后出现浑浊既可以是蛋白质也可以是磷酸盐，故一定要加酸后再煮沸，此时磷酸盐消失，而蛋白质仍浑浊。另外尿蛋白量少时，加热后不浑浊而加酸后才浑浊，所以必须严格按照加热→加酸→再加热的程序。酸不能太少（pH值偏高）也不能太多（pH值偏低），否则会出现假阴性。因在本实验中白蛋白和球蛋白沉淀的前提条件是尿中有足够的电解质，对低盐患者，可因电解质少导致假阴性，此时要先加饱和氯化钠1～2滴，再进行实验。

（三）磺基水杨酸法

在酸性环境下，磺基水杨酸的酸根阴离子与带正电的蛋白质结合成不溶性蛋白盐而沉淀。本法操作简便，灵敏度高，可检验多种蛋白，但易造成假阳性。

1．方法

取透明试管，加入尿液3～5ml，加100g/L磺基水杨酸乙醇溶液3～4滴，轻摇试管，1min后观察结果。正常为阴性，无浑浊，否则为阳性。

2．评价

本方法更为敏感，敏感性为＜100mg/L，除与白蛋白、球蛋白发生反应外，还与本周蛋白、血红蛋白反应。但当尿中存在较多的尿酸（盐）或草酸盐时也可假阳性（为蛛丝状浑浊），使用某些药物如青霉素、碘剂也可造成假阳性，但加热后消失，借此可鉴别。本方法影响因素较多，难于指导治疗。

二、尿蛋白的定量分析

当尿蛋白的筛查实验为阳性时，则应做定量实验，长期以来，24小时尿蛋白定量（24hUp）一直做为定量的经典方法。但这种标本的留取很麻烦，不仅要准确留取并测量尿量，而且还要提前添加防腐剂。

（一）双缩脲法

以磷钨酸乙醇液沉淀蛋白质，后者在碱性介质中与Cu^＋＋作用，形成紫色洛合物，经与标准管比色即可算出蛋白的含量。

（二）考马斯亮蓝法

在酸性介质中考马斯亮蓝G-250与尿蛋白的NH3＋基团结合，发生颜色改变，经与标准管比色即可算出蛋白的含量。

三、尿蛋白/尿肌酐（urinary protein/creatatine，P/C，单位g/g．cr）

由于24hUp在留取标本时繁琐费时实在不方便，而且尿蛋白浓度随着尿量增减变动很大，不能准确反映真实的尿蛋白情况。近些年一些学者，包括美国K/DOQI指南，建议采纳随机尿或晨尿并用尿肌酐来校正代替24小时蛋白定量，并经临床实验证明：P/C与24hUp之间有着良好的相关性和回归关系。我国著名学者王海燕教授等对此也进行了大量的实验，并提出两种留尿方法。

（一）方法

1．晨尿P/C

晨尿可以减少活动带来的影响，且为浓缩尿，容易阳性，是首推的留尿方法。其中蛋白测定推荐为双缩尿法，尿肌酐采用碱性苦味酸动力学法。

2．随机尿P/C

此尿标本受活动影响，同一患者采取两种方法留尿，会出现结果明显高于晨尿的差异，这与活动后尿蛋白增加有关。因此，在有条件的情况下，还是以晨尿标本为佳。

（二）评价

尽管该方法得到了国内外的一致认可，并得到了美国K/DOQI指南的推荐，但目前就其诊断界点（正常值）还没有一个统一。我国王海燕则认为：当Ccr＞10ml/min时，无论是晨尿的P/C还是随意尿的P/C，都与24hUp高度相关，但Ccr＜10ml/min时，不能使用P/C代替24hUp。用ROC的分析方法，24hUp分别为1g、3g时，P/C的相应值在特异性和敏感性为最佳时，其诊断界点为0．94g/g．cr和2．84g/g．cr。但最终还需要多中心、大规模的研究。

四、尿蛋白的定性分析（定位诊断）

尿蛋白性质分析有2个含义，一个是鉴定尿中蛋白的成分是何种蛋白（如白蛋白）或是以何种蛋白为主（如β2-M），以此来进行定位诊断（如肾小球/肾小管）或特殊疾病的诊断（如多发性骨髓瘤），二是在非显性蛋白尿（常规检查阴性）的情况下，对尿蛋白进行微量（在μg或μμg的水平上）分析，以便对某些疾病做出早期诊断，如尿微量白蛋白对糖尿病肾病和高血压肾病的早期诊断有重要的意义（见图2-16）。

图2-16　尿蛋白的分类与定位关系

（一）肾小球性蛋白尿

肾小球性蛋白尿是指肾小球基底膜电荷屏障或和分子屏障受到损伤，使尿蛋白“漏”出过多，超过了肾小管的再吸收能力，引起的蛋白尿。其特点是以中分子以上的蛋白为主，白蛋白做为其特征，蛋白量不等，但多＞＋＋或＞1g/24h。

1．白蛋白（albumin，Alb）/微量白蛋白（microalbumin，mAlb）

白蛋白是由肝脏细胞合成的，为含585个氨基酸残基的单链多肽，分子量66458，半衰期15～19天。是血浆中含量最多的蛋白，占总蛋白的40～60%。正常肾小球基底膜的滤孔直径为5．5nm，而白蛋白的直径为7．2nm，且带负电，所以难于通过肾小球，故正常尿中仅含有微量。尿中出现白蛋白是肾小球损伤的重要标志，而出现微量白蛋白（mAlb，指常规尿蛋白定性阴性的情况下，常需要用其他的方法检测）则是肾小球早期损伤的敏感指标，是糖尿病、高血压损伤肾小球最早出现的改变，目前多采用两种方式做为标准化，一是24小时尿总白蛋白（＞30mg为界点），另一个是白蛋白排泄率（＞20μg/min为界点）。但目前的主要问题是mAlb的测定及应用要进一步规范化，美国糖尿病协会（ADA）建议mAlb的诊断不能只凭一次结果，而要连续检测3次（每3～6个月1次），而其中至少有2次明显升高。另外对标本的采集和报告单位也要有一个明确的、统一的规定：标本要留取24小时尿，如采用一次尿（spot urine）则要求用尿白蛋白/肌酐比值（albumin/creatinine ratio，ACR）法，单位用μg/mg或mg/g才能做为诊断依据。

2．转铁蛋白（transferrin，TRF）

是另一项肾小球损伤的标志物，但其利用率不及mAlb。主要在肝细胞合成，为单链糖蛋白，分子量77KD，半衰期7天。是血浆中主要的含铁蛋白质。负责运载由消化道吸收的铁和由红细胞破坏释放的铁进入到骨髓，供红细胞生成。血中的TRF主要用于贫血的诊断。在急性炎症、肝功能障碍、营养不良、大量蛋白丢失等，都可以使其下降。尿中TRF增高，也是肾小球病变的特征，主要反映电荷屏障的损害。由于TRF的等电点较白蛋白高，带有较少负电荷，而肾小球滤过膜富含的HSPG和唾液酸带有大量的负电荷，当TRF通过滤过膜时，受到的电荷排斥力较白蛋白小，故它较后者更容易漏出，因而能更敏感地反映肾小球电荷屏障的受损。

3．免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）

是血中5种Ig中含量最多的，分子量160KD，也是在尿中唯一能测到的Ig，因分子量大，正常时，肾小球不能滤过，只有当肾小球发生病变时，尿中才会出现，主要反映了分子屏障的损害。因尿IgG排出总是比尿Alb晚，所以它反映肾脏病变的加剧，表示肾小球功能受到较严重的损害，是非选择性蛋白尿的标志。但尿路的粘膜也会分泌极少量的IgG，所以，一些尿路的损伤、炎症，也会使IgG轻度增高，在分析时，应加以判断。

（二）肾小管性蛋白尿

肾小管性蛋白尿是指由于各种原因导致的肾小管重吸收障碍，不能将肾小球滤过的蛋白进行重吸收，从而导致的尿蛋白。肾小管损伤的特征是以小分子为主的蛋白，占70%以上，而白蛋白只占20%左右。代表肾小管损伤的主要标志物有两大类，一类是小分子量的蛋白，一类是尿酶。前者主要包括：β2-微球蛋白、α₁-微球蛋白、视黄醇结合蛋白，后者主要是尿NAG酶。肾小管性蛋白尿的特点是：量相对较少，蛋白定量常＜＋＋或＜1g/24h，其临床意义主要见于①急性肾损伤（急性肾小管坏死、急性间质性肾炎）；②小管-间质疾病（如Batter综合征、范可尼综合征）；③鉴别上/下尿路感染（上尿路感染时增高，动态观察还可判定疗效）；④一些疾病对小管的早期损害（糖尿病、高血压）（见表2-28）。

表2-28　几种常见的尿蛋白临床意义

1．β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）

是有核细胞产生的，并存在于细胞表面，是HLA的一部分。它含100个氨基酸和1个二巯键的单链多肽，分子量11800。β2-MG能正常通过肾小球滤过膜，但几乎被近曲小管以胞饮的方式摄取，在细胞内分解为氨基酸，再返回血液。近曲小管是β2-MG降解的唯一场所，因此，一旦肾小管损伤便不能重吸收，尿中就会出现该蛋白。由于尿中的β2-MG在pH＜5．2以下时，极易分解，所以在留取标本时应该特别注意，要么立即测定，要么调节pH6．5～7．0暂时保存，否则会影响结果的判定。

2．α₁-微球蛋白（α₁-microglobulin，α₁-M）

主要在淋巴细胞和肝脏中产生，广泛分布于人体各种体液中及淋巴细胞膜表面，是由167个氨基酸组成的糖蛋白，分子量27000，它与人类白细胞抗原HLA-ALL、HLA-B20、HLA-BWS1等抗原决定簇有交叉反应。血液中的α₁-M分游离型和与IgA结合的两种形式。正常情况下，可自由通过肾小球滤过膜的是游离型α₁-M，并在近曲小管几乎全部重吸收并分解代谢。近年来α₁-M在肾功能的监测作用逐渐受到重视，当肾小管受损时，尿中α₁-M首先增加，比尿中β2-MG敏感，这是由于肾小管对α₁-M的重吸收障碍先于β2-MG，尿α₁-M不受尿液酸碱度影响，与其它低分子蛋白相比是较好的反映肾小管受损的早期灵敏指标。

3．视黄醇结合蛋白（Retinol-BindingProtein，RBP）

是血液中视黄醇（维生素A）的转运蛋白，它是由肝脏合成的一种低分子量蛋白，RBP分子由一条多肽链及小部分碳水化合物组成，不含中性糖及氨基己糖，分子量为21KD，等电点pH4．4～4．8，半衰期3～12小时。广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中，主要功能是将视黄醇从肝细胞转运到周围组织的上皮细胞，血浆中的RBP与视黄醇、前白蛋白以1∶1∶1（mol）的复合物形式存在，形成高分子蛋白复合物，此复合物可降低RBP在肾脏的分解及肾小球的滤过。但当视黄醇被转运到靶细胞后，RBP便游离到血浆中，迅速被肾小球滤过，几乎全部被肾小管上皮细胞重吸收，并被分解供组织利用，仅有少量从尿中排出。RBP在尿中稳定性强，不易分解，不受pH值干扰。RBP排量增加可作为肾近曲小管损伤的标志物。

4．尿酶（见肾小管功能检查）

5．评价

上述的有关肾小球和肾小管的检查，对早期诊断和定位诊断都有重要的意义，被称做为肾损伤早期检测体系（Early　Detection Sysem for Renal in juries），但需要规范化。各单位可以结合本单位实验室的具体情况和习惯，可单独做也可选择性的组合，其原则是代表肾小球中的蛋白，至少选择2个，一个是中分子的白蛋白，另一个选择大分子的蛋白，多选IgG。代表肾小管的蛋白，一般选择2个即可。按目前的认识，β2-MG因在尿中不稳定，已逐渐被Cystatin　C和α₁-M所取代。由于肾小管损伤的标志物受生理因素（尿量、运动）影响，理论上测定24小时尿可以消除这种影响，但可操作性差，为此，现在国际上通行的准则是用留取任一次尿标本做检测的同时用尿肌酐比值（待测物质量/肌酐）来校正。这其中包括mAlb、Cystatin　C、α₁-M和β2-MG。

（三）溢出性蛋白尿

是指肾小球滤过和肾小管的重吸收功能均正常情况下，由于血中某种小分子的蛋白浓度过高，经正常（或异常？）的肾小球滤出，超过肾小管的重吸收能力引起的蛋白尿称为溢出性蛋白尿。临床上最常见的是免疫球蛋白的轻链。

1．轻链（light chain）

是免疫球蛋白（Ig）的组成部分。正常人Ig含有2个重链和2个轻链。与IgA、IgG、IgM、IgD、IgE相对应的重链分别是γ、α、μ、δ和ε，轻链则仅含κ（kappa）和λ（Lambda），在1个Ig中，两个轻链的比接近2∶1，游离轻链也叫本-周蛋白（bence Jones），又因该蛋白在40～60℃凝固，温度上升到90～100℃再次溶解，所以又叫凝溶蛋白。轻链的分子量为22000，以单体或二聚体形式存在。轻链由浆细胞产生，正常情况下，轻链和重链的分泌是平衡的，二者结合成完整的免疫球蛋白。轻链κ和λ的基因分别在2号和22号染色体上，正常合成一个分子的Ig（2轻2重）需要36min，其中1条轻链10min，而1条重链则需要18min，组成1条完整的Ig就要有1条以上的轻链过剩。当有增殖性疾病时，合成速度明显加快，此时合成一个分子的Ig（2轻2重）只需要5min，其中1条轻链1min，而1条重链仅需要2．5min，同样会造成轻链的过剩。无论是正常还是异常的过剩轻链，都由B细胞分泌到胞外，肾脏是游离轻链清除的唯一器官，正常情况下，轻链能自由通过肾小球的基底膜，但在肾小管90%重吸收，10%随尿排出，故尿中仅有微量的轻链。正常尿中＜4μg/ml或＜2mg/24h，且κ/λ为2∶1。对于人类κ和λ的比值是固定的，κ-Ig占66%，λ-Ig占34%，这个比例可以做为单克隆和多克隆Ig增殖的鉴别。

（1）临床意义

①单克隆或恶性浆细胞病：单一轻链大量合成，所产生的Ig是同质的，尿中有大量过剩的游离轻链，即B-J蛋白。此轻链是κ或λ，因此造成κ/λ的非正常比例（2∶1），使比例变为＞2∶1或＜2∶1。同时血浆中有单克隆增殖的M蛋白。如多发性骨髓瘤、原发性淀粉样变、轻链病、恶性淋巴瘤。

②多克隆增殖：多克隆Ig增殖，过剩的轻链大量出现在尿中，可达200μg/ml，一般方法就可测出，但κ/λ仍为2∶1。多见于继发性疾病，如SLE、慢性感染、急慢性肝炎、肝硬化等。

③轻链病：尿中的轻链属于单克隆，含量大，血中不增加，无M蛋白，甚至低于正常。也有人认为是多发性骨髓瘤的特殊类型或流产型。

④某些疾病的早期肾脏损害指标：高血压、糖尿病。

⑤某些肾脏病：有报道在各类肾脏病中κ阳性率为41%，而λ阳性率为16．2%，其中以肾病综合征的阳性率和含量最高，以κ为主，可为正常人的5倍。

（2）评价。

正常和疾病时，血和尿中都存在微量的游离轻链，用一般的方法是无法测出的，用RIA或ELA，可以检测到微量的水平。结合到Ig分子上的两条轻链，虽然与重链以二巯键结合成大分子，但用抗轻链抗体仍能测到它的存在，以此可以区别κ和λ型Ig，即结合轻链，结合轻链的检查对诊断和鉴别诊断Ig增殖病的性质有重要意义。尿中有轻链并不等于就是B-J蛋白阳性，更不等于就是轻链病。

2．肌红蛋白

详见急性肾衰一章中有关肾小管坏死的相关内容。