有抗原刺激淋巴细胞免疫分析正常

二、淋巴细胞的检测

检测机体各群淋巴细胞数量和功能，可以了解机体的免疫状态，对某些疾病的诊断、疗效及预后观察有一定帮助。外周血是病人主要检测标本。

(一)淋巴细胞分离

首先从外周血中分离出淋巴细胞和单核细胞。取肝素抗凝的静脉血，加入淋巴细胞分离液离心，红细胞和粒细胞沉入管底，分离液面上即为单个核细胞。

利用单核细胞能黏附玻璃、塑料，吞噬异物的功能，可将其除去。淋巴细胞悬液通过尼龙毛管时，B淋巴细胞表面有大量膜表面免疫球蛋白及其他受体，会被黏在尼龙毛管上，以此分离出B淋巴细胞。亦可加入绵羊红细胞后离心，分出T淋巴细胞。将已知抗细胞表面标记的抗体交联于微珠磁颗粒，与细胞悬液混匀后，微珠借抗体结合于相应细胞群或亚群表面，将细胞悬液通过磁场中的分离柱。因微珠被磁场吸引，可将磁珠结合的细胞与磁珠非结合细胞分开，从而获得高纯度的细胞，这种方法为磁珠分离法。用流式细胞仪可对免疫细胞进行快速准确的鉴定和分类。

(二)淋巴细胞数量测定

1．T淋巴细胞数量测定　传统的方法为E花环计数法，先将被测定的外周血经淋巴细胞分离液分离，获得单个核细胞后，再加入绵羊红细胞，一定条件下，两者混合作用后，结合绵羊红细胞形成花环的细胞即为T细胞。计算花环形成细胞占淋巴细胞的百分数，可反映体内T细胞总数。

更为简便的方法用抗CD₂或抗CD₃的单克隆荧光抗体来检测，在显微镜下计数荧光抗体结合的细胞，即为T淋巴细胞。

2．B淋巴细胞数量测定　B淋巴细胞可用EA花环或EAC花环形成方法来测定。B淋巴细胞表面有IgGFc受体，可制备红细胞抗体，为区别T淋巴细胞的E花环，用牛红细胞或鸡红细胞与相应抗体结合，加入到单个核细胞中。B淋巴细胞表面的Fc受体与红细胞抗体结合，形成EA花环。如果将红细胞与抗体结合后加少量补体，则通过补体与B淋巴细胞表面的补体受体结合，形成EAC花环。EA花环，EAC花环的数目即代表B淋巴细胞数。

(三)淋巴细胞功能测定

1．T淋巴细胞功能测定

(1)T淋巴细胞转化试验:将单个核细胞加入培养液中培养，培养液中有丝分裂原(PHA)，能刺激细胞增殖，一般培养72小时。如在培养终止前加入氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H－TdR)，3H－TdR迅速被即将有丝分裂的T淋巴细胞吸收用于合成DNA。故仪器测得的带放射性氚的细胞即为增殖的T淋巴细胞。由于在培养72小时左右时，T淋巴细胞处于淋巴母细胞阶段，尚未完成有丝分裂，这样的细胞在显微镜下体积大，核膜消失。T淋巴细胞培养成此状态被称为转化。正常转化率为70%左右，转化率的高低可反映人体的细胞免疫功能。

为避免放射性物质的损害，可在终止前用四甲基偶氮唑盐(MTT)代替3H－TdR，MTT被细胞浆内酶催化形成棕色化合物，用酶标仪测定OD值，值的高低代表增殖程度。

(2)细胞毒试验:Tc、NK细胞对靶细胞有直接杀伤作用，可根据待检效应细胞的性质，选用相应的靶细胞，如肿瘤细胞、移植供体细胞等。该试验用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面的研究。常用的有51Cr释放法、凋亡细胞检查法。

(3)T淋巴细胞功能测定的体内法:这是一种简便的测定方法。用一些能引起细胞免疫应答的抗原注入皮内，24小时后观察注射局部的反应，阳性者有红肿、硬结甚至溃烂，可维持数天。一般用结核分枝杆菌的蛋白，如旧结核菌素(OT)或纯蛋白衍生物(PPD)。细胞免疫正常者为阳性;细胞免疫低下者，如肿瘤患者多为弱阳性或阴性。

2．B淋巴细胞功能测定

(1)B淋巴细胞增殖试验:将待检者的单个核细胞与带有金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的金黄色葡萄球菌一起培养，SPA能刺激B淋巴细胞分裂增殖。温育一定时间后检查抗体形成细胞的数目。

(2)抗体形成细胞测定:常用溶血空斑试验。即测定对SRBC上的抗原产生的抗体形成细胞数目。先用抗原刺激机体，然后将待测B淋巴细胞、吸附抗原的SRBC、补体及适量的琼脂糖混合，倾注平皿，温育1～3小时。每个产生抗体的B淋巴细胞分泌免疫球蛋白结合SRBC，在补体参与下，SRBC溶解，在均匀红色的琼脂糖凝胶上出现分散的溶血透明空斑。每个空斑中央含有一个抗体形成细胞，又称空斑形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数目。