实验十八 人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备
1923年，美国遗传学权威得克萨斯大学校长Paint（1889～1969）提出人体的染色体数目为2n＝48。这后来作为一条定论充斥于各种教科书和百科全书。直到1956年美籍华裔学者蒋有兴（Tjio JH）和Levan才首先正确鉴定了人类染色体是2n＝46条，而不是48条（蒋有兴因此荣获了美国肯尼迪国际奖）。但首先观察到46条染色体数目的却是美籍华裔科学家徐道觉（Hsu TC，1917～2003）。
徐道觉曾师从我国最著名的遗传学家谈家桢先生，被欣赏为最有出息的学生。1948年赴美学习，4年之后的一天晚上，徐道觉照常到实验室做研究。在一些治疗性流产的胚胎组织（皮肤和脾）培养标本中，竟然在显微镜下看到了铺展很好的染色体，他简直不敢相信自己的眼睛，到实验室外的咖啡馆里喝了一杯咖啡，清醒头脑之后再回到实验桌上，仍然观察到了同样的现象。没有1个分裂相有纺锤体定向，没有1个分裂细胞显示细胞分裂中期的边界，都不是典型的中期。他花了大约3个月时间，力图从各个因素的试验中寻找其“奥秘”——包括培养基的成分、培养条件、培养温度、秋水仙素、固定液和染色液等。直到当他改变平衡盐溶液的张力时才获得成功。当他把蒸馏水和平衡盐溶液相混合以减低张力时，“奇迹”又重新出现了。这一手段对所有生物和所有培养物一概都是适用的。可以肯定，在3个月之前出现的“奇迹”一定是实验室中的某一位技术员在配制平衡盐溶液时读错了刻度标尺以致配为低渗液的缘故，使得徐道觉成功地将低渗透液技术运用到人体染色体的研究上，使染色体得以很好地铺展，不再重叠，可以清晰地进行观察。由此，徐道觉确认了正确的人类染色体数目：2n＝46。
一、实验目的
（1）熟悉人类外周血淋巴细胞培养方法。
（2）掌握人类染色体标本制作过程。
（3）了解非显带的人类染色体的形态特征。
二、实验原理
人外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。在体外适宜培养条件下，经植物凝聚素（phyto－hemagglutinin，PHA）的刺激，可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期。当培养至72h，多数淋巴细胞已处于第二增殖周期内。这时用有丝分裂阻滞剂秋水仙素（colchicine）处理一段时间，使分裂的细胞停止在中期，经低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂中期细胞。人体的1ml外周血内一般含有约（1～3）×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。
三、实验用品
（1）材料：人体外周血。
（2）器材与仪器：培养箱、培养瓶、注射器、酒精棉球、离心机、刻度离心管、吸管、恒温水浴锅、定时钟、普通天平、量筒、冰湿载玻片。
（3）试剂：培养基、秋水仙素（12.5μg/ml）、肝素、0.075mol/L KCl低渗液、甲醇、冰乙酸、pH 6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液。
四、实验内容
（一）细胞培养（无菌操作）
（1）采血：乙醇（酒精）消毒皮肤，肘静脉采血0.3～0.5ml，立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向5ml培养基中注入15～20滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。
（2）培养：时间为68h。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。
（3）秋水仙素处理：终止培养前2～4h，在培养液中加入秋水仙碱（用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml）。轻摇混匀后，继续培养至72h，以积累更多的中期分裂细胞。
（二）染色体的制备
（1）收获细胞：用吸管吸取培养物，移至离心管中，以800～1 000r/min离心10min，弃去上清液，留下沉淀物约0.3ml。
（2）低渗处理：加入预温37℃的低渗液至4ml，用吸管轻吹打混匀，置于37℃恒温水浴锅中低渗20min，促使细胞膨胀，染色体分散（操作时，要注意不要将细胞吸到吸管上部，也不要接触离心管的上部，否则会丢失许多细胞）。
（3）预固定：低渗处理后，沿管壁缓缓加入1ml新配制的固定液，立即用吸管轻吹打混匀。以1 000r/min离心10min，弃上清液，留约0.3ml沉淀物。
（4）固定液：加入新鲜固定液至5ml，吸管吹打混匀，室温固定20min，离心，去上清液。依上述方法再重复固定1次或2次（固定液要新鲜配制，否则会形成酯类，影响固定效果）。
（5）制备细胞悬液：离心后预留0.2～0.3ml固定液或另加新鲜固定液（视细胞多少而定），用吸管吹打混匀，制成细胞悬液。
（6）滴片：取保存在清洁冰水中的冰湿载玻片一张，用吸管吸取细胞悬液，距玻片10～20cm的高度滴2～3滴于玻片上（不要滴重叠），立即用口吹气，使细胞在玻片上散开，滴片后斜放，室温中空气干燥。
（7）染色：使用Giemsa染液染色10min，自来水轻冲洗，晾干后即可镜检。
将制作好的片子先在低倍镜下找到分散良好、长度适中的分裂相，再转至油镜下仔细观察。染色体数目为46XX，（XY）为人类正常核型。若某对染色体少了一条（2n－1），细胞染色体数目为45；或某一对染色体多了一条（2n＋1），细胞染色体数目为47；若为两种核型，46，XX/46，XXY称为嵌合体。以上3种为异常核型。
五、注意事项
（1）培养温度应严格控制在（37±0.5）℃，培养液最适合pH为7.2～7.4。
（2）秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。
（3）低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。
（4）低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。
（5）离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。
（6）固定液应在使用前临时配制。
（7）载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。
六、作业与思考题
每人交一张制作好的染色体标本片。
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