细胞凋亡的机制

第二节　细胞凋亡的机制

多细胞个体在凋亡过程中大多拥有相似的酶反应过程。死亡受体和线粒体介导的两条通路是经典的细胞凋亡信号传导通路，此外还有近年来研究发现的过度内质网(ER)应激启动的细胞凋亡信号传导通路。

一、死亡受体介导的细胞凋亡

死亡受体属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)基因家族，其共同特征是都有相似的、富含半胱氨酸的细胞外结构域和一个同源的称为死亡结构域(death domain，DD)的胞内序列。死亡结构域一般使死亡受体与胞内凋亡机制相连，但它们有时也会介导与凋亡无关或抑制凋亡的过程。

(一) FasL-Fas系统介导的细胞凋亡

自杀相关因子(factor associated suicide，Fas)是广泛表达于正常细胞和肿瘤细胞膜表面的Ⅰ型受体，其胞质段内由含有60～80个氨基酸组成的死亡结构域及阻抑域(suppresive domain，SD)。Fas的SD被Fas结合磷酸酶-1(fas-associated phosphatase-1，FAP-1)结合后可抑制Fas的诱导凋亡作用。

Fas的配体FasL(Fas ligand)主要表达于T效应淋巴细胞和肿瘤细胞，是呈现于膜表面的Ⅱ型受体。Fas和FasL都是以纯三聚体形式存在，在FasL同靶细胞膜表面的Fas结合后，诱导Fas胞质段内的DD结合Fas结合蛋白(fas associated protein with DD，FADD)，FADD再以其N端的死亡效应子域(death effector domain，DED)结合前胱冬肽酶-8或-10，形成一个由Fas-FADD-前胱冬肽酶-8(或-10)3种分子组成的复合体，称为诱导死亡的信号复合体(death inducing signaling complex，DISC)，其中前胱冬肽酶-8(或-10)就可以自身催化形成活性的胱冬肽酶-8，由此完成了由Fas介导的死亡信号起始转导(图13-3)，接下去进行级联反应激活下游的靶前胱冬肽酶(包括前胱冬肽酶-3，-6，-7)。活性的胱冬肽酶-8尚可催化Bid(Bcl-2族的促凋亡分子)，其N端1～60个氨基酸是Bid的抑制区段，N端第60和61位氨基酸之间的肽腱断裂，其活化的C端部分转位到线粒体膜降低其跨膜压，引起线粒体内细胞色素c和前胱冬肽酶-2，-3，-7，-9等死亡因子释放出来。由此通过形成凋亡激活复合体(apoptosome)，其中前胱冬肽酶-9自身激活而增大Fas介导的死亡信号转导反应。

图13-3　FasL-Fas介导的细胞凋亡

(二) TNFα-TNFR1系统介导的细胞凋亡

TNFα及其受体介导的信号通路不是专职负责细胞凋亡的信号转导通路。其受体有TNF-R1和TNF-R2两种亚型，但只有TNF-R1胞质段含有DD，故TNFα引起细胞凋亡的信号转导途径是由TNF-R1介导的。TNFα在诱导细胞凋亡时，与Fas一样，首先自身三聚体化，再与TNFR的胞外区3个分子结合，导致其胞质部分聚集成簇。此后，可通过几条不同的传导通路，诱导细胞凋亡。TNFR既可像Fas一样，直接与FADD结合引发信号下传，也可先与TRADD(TNFR1-associated death domain protein)结合，由于TRADD不含DED结构域，不能直接与Procaspase结合。因此，信号的传递又可通过以下3条通路传导:①TRADD与FADD结合，引发信号下传。②TRADD通过TRAF2(TNF-receptor-associated factor 2)分别导致JNK和NF-κB活化，活化的JNK诱导细胞凋亡，而活化的NF-κB则抑制细胞的凋亡。当JNK和NF-κB同时被激活时，则细胞表现为存活。③TRADD还可选择性地与RIP(receptor interacting protein)结合而激活另一条凋亡通路，RIP与RAIDD(RIP-associated ICH-1/CED-3-homologous protein with a death domain)结合诱导凋亡(图13-4)。

图13-4　TNFα-TNF-R1介导的细胞凋亡

二、线粒体介导的细胞凋亡

在脊椎动物细胞的凋亡过程中，线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置。死亡信号诱使线粒体渗透性转换孔(permeability transition pore，PTP)开启，导致了线粒体跨膜电位(ΔΨm)的崩解，从而使凋亡相关活性物质释放，并继而对胱冬肽酶激活是细胞凋亡实现最根本的生物化学途径，其中Ca²⁺的释放、质子的渗漏以及细胞色素c的释放等都起到了关键作用。细胞色素c从线粒体膜间隙释放出来后即与胞质中Apaf1(线虫CED-4的同源物)结合活化胱冬肽酶-9，进而激活胱冬肽酶-3，导致细胞凋亡。Bcl-2通过阻止细胞色素c从线粒体的释放来抑制凋亡;而Bax通过与线粒体上的膜通道结合促使细胞色素c的释放而促进凋亡。最近的研究表明，Fas途径中胱冬肽酶-8活化后切割胞质内的Bid(Bcl-2家族成员)，使之进入线粒体，引发细胞色素c高效释放。Bid诱导细胞色素c释放的效率远高于Bax。

此外，定位于线粒体上的转录因子p53能与Bak、Bax直接相互作用，这种相互作用解除了Bak与Mcl-1(Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白)的结合，使Bak中的BH³结构域外露，从而处于促凋亡的结构构象;这种相互作用还引起Bak、Bax多聚化，导致线粒体通透性的改变，使各种促凋亡因子释放到细胞质中。

线粒体释放的另一凋亡诱导因子是凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)，其相对分子质量约49605，是一种黄素蛋白。正常生理状态下，AIF被封闭于线粒体中，在细胞发生凋亡时被转运入细胞核。重组的AIF能诱导细胞核中染色质凝集和DNA大规模降解。AIF还能诱导纯化的线粒体释放细胞色素c和胱冬肽酶-9。

线粒体是细胞的能量代谢中心，细胞凋亡过程中对线粒体最直接的损伤是其功能丧失。线粒体功能障碍除导致自由基产生增加、兴奋性氨基酸释放增多、Ca²⁺超载而引起细胞凋亡外，同时还能直接诱导细胞凋亡。此过程中线粒体的能量贮备起决定性的作用，如果损伤程度相对较轻，ATP保留了提供细胞凋亡所需的能量，则发生细胞凋亡;若损伤严重，ATP急剧耗竭，则发生细胞坏死。有研究表明，细胞内ADP与ATP的比值是细胞存活或凋亡的决定因素，比值低于0．2时细胞存活;比值大于此值细胞则将发生凋亡。

三、ER介导的细胞凋亡

ER是细胞内蛋白质合成的主要场所，也是主要的Ca²⁺库。ER在维持细胞内Ca²⁺的稳定以及膜蛋白的合成、修饰和折叠等方面有着关键性作用，近年来研究发现ER在凋亡信号处理过程中也发挥着重要作用。引发ER介导的细胞凋亡这一信号传导通路包括非折叠蛋白反应和Ca²⁺起始信号等机制。在ER Ca²⁺平衡的破坏或者ER蛋白过量积累等应激情况下，ER膜上的胱冬肽酶-12基因被诱导表达，同时也导致胞质的胱冬肽酶-7转移到ER表面。胱冬肽酶-7激活胱冬肽酶-12，激活的胱冬肽酶-12裂解胱冬肽酶-3等下游效应蛋白酶，最终导致细胞凋亡。

过度ER应激会出现胞质内Ca²⁺浓度迅速持续地升高，可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶，又可以作用于线粒体，影响其通透性并导致其膜电位的改变，从而涉及线粒体及细胞色素c的协同作用而使胱冬肽酶激活和细胞凋亡。

四、凋亡相关基因

在细胞凋亡的分子生物学研究过程中，发现了有多种基因及基因家族参与细胞凋亡的调控，其中包括胱冬肽酶基因家族、Bcl-2基因家族、p53基因、Fas/Apo基因及c-myc基因等。

(一)胱冬肽酶基因家族

1993年，人们在C．elegans中发现一个编码细胞死亡的基因ced-3与动物细胞中白细胞介素1β转化酶(interleukin-1β-converting enzyme，ICE)基因结构相似。目前在人类中至少有11种ced-3/ ICE成员被发现。它们都属于半胱氨酸蛋白酶，可以水解底物中特异位点的天门冬氨酸，也可以水解自身特异位点的天门冬氨酸而活化自身，因此，目前称它们为胱冬肽酶半胱氨酸天冬氨酸酶。所有胱冬肽酶均以酶原形式合成，它们可通过自身活化、转位活化或被其他蛋白酶水解活化。

不同胱冬肽酶在结构上有两点显著不同:第一，底物结合位点明显不同，导致不同胱冬肽酶具有各自的底物特异性。第二，不同胱冬肽酶位于N端的前结构域(prodomain)长度和氨基酸组成有很大不同;使胱冬肽酶在凋亡信号转导途径中执行着不同的功能(表13-2)

表13-2　不同胱冬肽酶的特征

(二) Bcl-2基因家族

Bcl-2基因家族包括两大类:一类可抑制细胞凋亡，如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和Bfl-1/A1等;另一类可促进细胞凋亡，如Bax、Bak、Bok、Bad、Bid、Bik、Bim、Hrk/dp5和Noxa等。

许多Bcl-2家族成员的C端都含有疏水尾巴将蛋白质定位在线粒体外膜、ER和核被膜上。抑制凋亡的Bcl-2成员都含有Bcl-2同源区(BH)BH¹、BH²、BH³、BH⁴，其中BH¹、BH²和BH³区在一级结构上相距较远，但在三级结构上它们位于同一位置，并形成一个疏水裂缝，与促凋亡蛋白的BH³区结合。

Bcl-2家族成员中抑制凋亡的蛋白与促进凋亡的蛋白之间可形成异二聚体，调节细胞的凋亡，还可通过磷酸化和脱磷酸化修饰其活性。另外，有些成员与线粒体膜上小孔的形成有关，可改变线粒体膜的通透性。位于线粒体外膜上的电压依赖阳离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)是Bcl-2家族成员作用的靶目标之一，如Bcl-2和Bcl-XL可关闭此通道，而Bax和Bak可使它开放。因此，Bcl-2家族也可通过改变线粒体的通透性调节细胞的凋亡。

(三)Fas和Fas-L

Fas又称为APO-1，属于死亡受体(death receptor)家族，家族中还有TNFR1、TNFR2、CD30、CD40和CD27等，是Ⅰ型膜蛋白，其细胞外部分含2～6个重复的半胱氨酸富集区，成员之间有25％的同源性;相反，胞质部分则很少有同源性。1993年，人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。

Fas基因编码产物为相对分子质量45000的跨膜蛋白，分布于胸腺细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、内皮细胞、上皮细胞以及皮肤角质形成细胞等。

FasL是TNF家族成员之一，家族中还包括CD30配体、CD40配体、CD27配体、4-1BB配体和TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)等。Fas L以Ⅱ型膜受体的形式合成，即N端位于胞质中。不同成员之间变异较大，C端延伸到细胞外，成员之间有20％～25％的同源性。

Fas与FasL组成Fas系统，两者的结合导致靶细胞走向凋亡。Fas和FasL可因基因突变而丧失功能，从而导致淋巴增殖性疾病发生以及自身免疫加剧，导致组织破坏。

(四)p53基因

p53基因是一种抑癌基因，其生物学功能是在G2期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其凋亡。研究发现丧失p53功能的小鼠胸腺细胞对糖皮质激素诱导的凋亡反应和正常细胞相同，而对辐射诱导的凋亡不敏感。

(五)c-myc基因

c-myc的主要作用是参与转录，而在转录过程中可以激活启动而诱导细胞周期进程和分化，也可以抑制启动而导致阻止细胞分化或程序化死亡，因此它既是激活因子，又是抑制因子。

除了以上凋亡相关基因外，随着研究的不断深入，还发现存在其他多种可能与凋亡调控有关的基因，只是有些研究起步较晚，许多机制尚无法阐明。