第五节 培养细胞的生物学特性分析
一、培养细胞的常规观察
培养细胞在体外的生长过程是一个动态的连续过程，细胞的数目、形态以及培养基的颜色、澄明度等在一定程度上都是细胞生长状况的表现。借助于肉眼或显微镜的帮助，通过对上述常规指标的观察，可以有效地帮助我们及时把握细胞的生长信息，适时、适当采取相关措施培养好细胞。
（一）培养基的观察
培养基的颜色和澄明度是肉眼观察的两个重要指标。新鲜的培养基一般呈桃红色，pH为7．2～7．4，培养过细胞后的培养基由于含有大量细胞代谢产物而使pH降低，颜色也逐渐变黄。培养基颜色的这种变化是由其所含有的酚红指示剂来显示的，酚红会随溶液的pH变化而改变颜色，成为指示培养基pH的最直观指标。培养基颜色变黄是细胞需要更换培养液的信号。一般情况下，大多数细胞每2～3天换液一次。需要注意的是，如果细胞在换液或传代后培养液很快就会变黄，这可能是细菌污染或培养瓶不干净造成的。
正常情况下，无论颜色如何变化，培养基都能保持澄明。一旦发现培养基变浑浊，就应注意是否有污染发生。上述情况多适用于贴壁生长的细胞，对于悬浮生长的细胞来说，随着细胞密度的升高，培养基也会在一定程度上变浑，判断其是否污染应结合溶液颜色变黄的速度、细胞增殖的速度、显微镜下是否可观察到污染以及其他一些方法进行判断。
（二）显微镜检查
利用光的衍射与干涉原理制造的相差显微镜是观察透明活细胞的最佳工具，可以清晰地帮助我们看到生活状态下细胞的形态、结构特点，并动态观察和记录细胞的附着、贴壁、伸展、移动、分裂等过程。
在不具备相差显微镜的实验室，普通的倒置显微镜也不失为一种好的观察工具。生长状况良好的细胞在倒置显微镜下观察时较为明亮、折光性也强，细胞的轮廓不清但形态规则。生长状况不佳的细胞在倒置显微镜下观察时折光性变弱、轮廓变得清晰，细胞形态也变得不规则，细胞间的间隙变大，细胞中常出现颗粒样物质，情况更严重时，还可见到脱落死亡的细胞增多。
二、细胞活力测定
（一）台盼蓝染色测定细胞活力
死细胞和受损细胞的细胞膜通常因缺损而不完整，这样某些染料分子便可穿过细胞膜进入到细胞内部并使细胞被染上相应的颜色。与死细胞和受损细胞不同，活细胞的细胞膜结构完整，能阻止染料进入细胞而拒染（dye exclusion）。台盼蓝便是这样的染料，经台盼蓝染色的死细胞或受损细胞常为浅蓝色。除台盼蓝外，伊红、苯胺黑也是常用的鉴定细胞活力的染料，所不同的是，经伊红和苯胺黑染色的死细胞或受损细胞分别为红色和黑色。
1．仪器、用品与试剂：血细胞计数板、显微镜、微量加样器、0．4%台盼蓝溶液（用PBS溶液配制）。
2．操作步骤
（1）将贴壁细胞用胰蛋白酶消化后再经Hanks液洗涤后制备单细胞悬液，并适当调整细胞密度在106个/ml左右。
（2）取细胞悬液0．5ml加入一小试管中，加入0．5ml 0．4%台盼蓝染液，染色2～3min。
（3）用微量加样器吸取少量细胞悬液加入到血细胞计数板上的小室中。
（4）显微镜下计数500个细胞，分别数出死细胞和活细胞数目，计算细胞活力。
（5）结果判定：死细胞能被台盼蓝染上色，镜下可见其为浅蓝色的细胞，活细胞不能被染色，镜下呈无色透明状。
细胞活力（%）＝
3．注意事项
（1）和台盼蓝溶液混合后的细胞悬液不可放置时间过长，因为活细胞对染料也有一定摄取能力，若时间太长，活细胞也会被染色。
（2）细胞悬液和台盼蓝溶液的用量可根据实验条件及要求进行必要的调整。
（3）血细胞计数板用完后要及时用双蒸水、70%乙醇认真清洗计数板和盖玻片并用擦镜纸擦干后保存。
（二）MTT法测细胞相对数目和相对活力
四唑盐比色实验是一种常用的检测细胞存活与生长状况的方法，实验所用之显色剂是一种能接受氢原子的染料，化学名为3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐，商品名是噻唑蓝，简称MTT。活细胞，特别是增殖期的细胞可通过线粒体代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶的作用，使外源性淡黄色的四甲基偶氮唑盐（MTT）被还原为蓝紫色的结晶物（formazan）并沉积在细胞中，其形成量与活细胞数呈正相关。利用DMSO或酸化异丙醇进一步溶解细胞中的紫色结晶物formazan，在酶标仪或分光光度计下测定490 nm波长处的光吸收值，可间接反映出活细胞数量的变化情况。
1．仪器、用品与试剂 超净工作台、酶标仪、微量加样器、RPMI 1640培养基（添加10%FBS）、96孔细胞培养板、细胞培养箱、恒温摇床、5mg/ml MTT溶液、酸化异丙醇（给异丙醇中加入HCl使最终达0．04mol/L）或纯的DMSO。
2．操作步骤
（1）接种细胞：取对数期生长的贴壁细胞经消化、洗涤后以一定密度接种在平底96孔板上，每组设3个平行孔，每孔200μl。
（2）培养细胞：将96孔板移入细胞培养箱，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。
（3）呈色：至收获前4h每孔加入20μl MTT溶液（5mg/ml），继续孵育4h后终止培养，从每孔小心吸弃上清100μl，再加入DMSO 150μl，置酶联免疫检测仪上振荡10min，以使结晶物充分溶解。
（4）比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果。
3．注意事项
（1）设空白对照。空白对照为不加细胞只加培养基，其他步骤与实验组相同，比色时以此孔调零。
（2）依据实验目的、细胞种类、细胞的生长习性选择适当的细胞接种密度和培养时间长短。一般情况下，96孔细胞培养板每孔最多可以生长1×105个细胞，切不可接种密度太高，致使培养终止前细胞过满，影响实验的区分度。
（3）高浓度的血清会导致实验本底增加，应尽量选择不超过10%FBS的培养条件。
4．附录
5mg/ml MTT溶液的配制：准确称取MTT 0．5g，溶于100ml的0．01mol/L pH7．4的PBS中，0．22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后，4℃下保存，两周内有效或－20℃冻存。
三、细胞的分裂指数
分裂指数是衡量体外培养细胞生长增殖状况的重要指标，常用细胞群体中分裂细胞所占的百分比来表示。分裂指数是测定细胞周期的一个重要指标，与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。同时，分裂指数也是不同实验研究选择细胞的重要依据。
（一）仪器、用品与试剂
超净工作台、细胞培养箱、普通显微镜、细胞培养皿、盖玻片、吸管、细胞培养基（如添加有10%FBS的RPMI 1640）、添加有0．02%EDTA的0．25%胰蛋白酶消化液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、PBS。
（二）操作步骤
1．将消化、洗涤后培养细胞以一定密度接种至内含盖玻片的培养皿中。
2．置细胞培养箱中培养48h，使细胞贴附在盖玻片上生长。
3．取出盖玻片，按下列顺序操作：PBS漂洗3min→固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1体积比）固定30min→Giemsa染液染色10min→自来水冲洗。
4．待盖玻片晾干后将其反扣在载玻片上，镜检。
5．计算结果：分裂指数＝分裂细胞数/总细胞数×100%
（三）注意事项
1．操作时动作要轻，以免使盖玻片上的细胞脱落。
2．细胞接种密度、培养时间有细胞的种类及生长习性决定。
（四）附录：Giemsa染液配制
1．Giemsa原液的配制：称Giemsa粉末0．5g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml），56℃中保温90～120min后再加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。
2．使用时按要求用PBS稀释，常用的稀释比例为1∶10。
四、集落形成实验
集落（克隆）形成实验是检验细胞存活率和增殖能力的有效指标。集落或克隆是指单个细胞在体外经6代以上增殖后所形成的细胞群体，直径大小常在0．3～1．0mm。正常细胞在体外培养时由于常需附着在坚硬的玻璃或塑料表面才能生长，而转化的或恶变的肿瘤细胞却常常丧失附着依赖生长的特性，可在软琼脂或甲基纤维素中以集落的方式生长。通过对集落的计数，不仅可以了解细胞的生存增殖能力，而且还可用于评价肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性、肿瘤放射生物学研究。
常用的集落形成实验主要有平板集落形成实验和软琼脂集落形成实验，此处主要介绍软琼脂集落形成实验。
（一）仪器、用品与试剂
超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、24孔细胞培养板、吸管、细胞培养基（如添加有10%FBS的RPMI 1640）、添加有0．02%EDTA的0．25%胰蛋白酶消化液、琼脂粉等。
（二）操作步骤
1．制备细胞悬液：取对数期生长贴壁细胞经消化、洗涤后用培养基根据实验要求稀释调整细胞密度，待用。
2．制备底层琼脂：用三蒸水配制5%的琼脂，高压灭菌后待温度降至50℃，加入预温的9倍体积培养基稀释，混匀后迅速给24孔培养板每孔中加入0．8ml，室温凝固琼脂。
3．制备上层琼脂：取0．6ml保温于50℃的5%的琼脂与9．6ml细胞悬液迅速混匀后立即加入到铺有底层琼脂的24孔培养板中，每孔0．8ml，室温凝固琼脂。
4．将培养板置细胞培养箱中培养7～14天。
5．倒置显微镜下计数集落数目，按下面公式计算结果。
集落数＝n个孔的细胞集落数总和÷孔数（n）
集落形成率＝（集落数÷接种细胞总数）×100%
（三）注意事项
1．制备琼脂凝胶时尽量避免气泡和局部结块的产生。
2．琼脂与完全培养基混合温度不要超过50℃，与细胞悬液混合时的温度不要超过40℃，以免降解培养基的营养成分和损伤细胞。
五、细胞生长曲线的绘制
生长曲线是测定细胞生长基本规律的重要指标，常通过每日或隔日连续计数细胞来绘制。广泛用于比较和评价各种药物、营养条件对细胞生长的影响。
（一）仪器、用品与试剂
超净工作台、细胞培养箱、显微镜、血细胞计数板、培养板或培养瓶、微量加样器、细胞培养基（如添加有10%FBS的RPMI 1640）、添加有0．02% EDTA的0．25%胰蛋白酶消化液、0．4%台盼蓝溶液等。
（二）操作步骤
1．取旺盛生长（对数期）的细胞，经胰蛋白酶消化、洗涤、计数后，以一定密度准确接种在不同组别的培养瓶或培养板中。
2．每隔24h或48h，取样3瓶（孔）细胞消化后用血细胞计数板计数细胞密度，结果取其均值。连续计数7～10天。
3．以培养时间为横坐标，细胞密度为纵坐标绘制生长曲线。
（三）注意事项
1．接种细胞的密度取决于细胞的生长特性和培养时间的长短。通常，所接种的细胞密度不宜太大，否则细胞很快就会进入增殖稳定期，短期内就得进行传代，所得曲线不能准确反映细胞的生长情况。
2．一般需在培养3～5天后给未计数的细胞统一进行换液。
3．生长曲线作为一种常规方法的缺陷是数值不够精确，对细胞生长规律的准确评价需结合其他方法进行，利用MTT法测定生长曲线就是一种较好的选择。
六、细胞周期的测定
细胞周期指细胞一个世代所经历的时间，即从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束所经历的时间，它反应了细胞增殖速度。测定群体细胞周期的方法很多，主要有同位素标记法、细胞计数法、流式细胞仪测定等。这里主要介绍利用BrdU掺入测定细胞周期的方法。
（BrdU）5－溴脱氧尿嘧啶核苷加入培养基后，可代替胸腺嘧啶核苷掺入到所复制的DNA新链中，经过一轮复制，在每条染色单体的一条DNA链均含有BrdU，但经染色后染色体却仍为深染。经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占总数的1/2，反映在中期染色体上表现为其中的一条单体浅染。但若经历了3个周期，则约一半的染色体的两条单体均浅染，另一半为一深一浅。这样，通过统计分裂象中各期的比例，就可算出细胞周期的值。
（一）仪器、用品与试剂
超净工作台、细胞培养箱、显微镜、吸管、废液缸、培养瓶、移液管、离心机、离心管、30W紫外灯、水浴锅、饭盒、擦镜纸、添加有0．02%EDTA的0．25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640细胞培养基（添加有10%FBS）、Hanks液、BrdU（1．0mg/ml）溶液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、秋水仙素、2×SSC液等。
（二）操作步骤
1．取对数期生长的细胞经消化、洗涤后以一定密度种植在培养瓶或培养板中。
2．细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。
3．培养44～54h后加入秋水仙素，终浓度为0．1μg/ml。
4．继续培养4～6h后，常规消化细胞至离心管中，注意培养上清液的漂浮细胞也要收集到离心管中。
5．按照常规染色体制备方法制片。
6．染色体玻片（有细胞一面向下）放在一饭盒中的玻璃支架上，加入2×SSC液以不超过标本表面为宜，然后在标本上覆盖一张擦镜纸，使纸的两边浸入2×SSC液中，以保持标本的湿润。
7．将饭盒放在56℃水浴锅中，湿育，上面用30W的紫外灯管，距标本6～10cm垂直照射30min。
8．弃去2×SSC液和擦镜纸，立即用4℃左右的流水冲洗。
9．Giemsa液染色5～10min，流水冲洗，干燥后镜检。
10．镜检100个分裂相，统计第一、二、三、四细胞期分裂指数。
11．根据下式计算细胞周期
细胞周期（Tc）＝48/｛（M1＋2M2＋3M3＋4M4）/100｝（h）
（三）注意事项
1．秋水仙素的加入时机会因细胞的类型、生长速度有所差异。
2．加入BrdU后应避光培养。
（四）附录
1．BrdU的配制：称取BrdU 10mg，无菌条件下溶于灭菌生理盐水中，定容10ml，4℃下避光保存，宜现用现配。
2．2×SSC溶液的配制：NaCl 1．75g，柠檬酸三钠·2H2O 0．885g，加水至100ml，4℃保存。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
