细胞培养的基本操作规程与细则

第七节　细胞培养的基本操作规程与细则

一、常用设备

单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。

二、配液室的设备

扭力天平和电子天平（称量药品）、pH计（测量培养用液pH值）、磁力搅拌器（配置溶液时搅拌溶液准备室的设备）。

培养室的设备：

液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯、紫外灯或电子灭菌灯、空气净化器系统、低温冰箱（－80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO₂孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

三、无菌操作

（一）无菌室的灭菌

1．定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏水或者苯扎溴铵（新洁尔灭）或者0．5%过氧乙酸擦拭。

2．CO₂孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰苯扎溴铵擦拭，然后用75%乙醇或者0．5%过氧乙酸擦拭，再用紫外灯照射。

3．实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20～30min。

4．实验后灭菌：用75%乙醇（3‰苯扎溴铵）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

（二）实验人员的无菌准备

1．肥皂洗手。

2．穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋。

3．用75%乙醇棉球擦净双手。

（三）无菌操作的演示

1．凡是带入超净工作台内的乙醇、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%乙醇擦拭瓶子的外表面。

2．靠近酒精灯火焰操作。

3．器皿使用前必须过火焰灭菌。

4．继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火焰。

5．各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。

6．吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

四、器械的清洗和消毒

（一）玻璃器械清洗消毒

1．新玻璃器皿的清洗消毒

（1）自来水刷洗，除去灰尘。

（2）烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀盐酸中12h以除去赃物、铅、砷等物。

（3）刷洗、烘干：12h后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

（4）泡酸、清洗：用清洁液（即酸液：重铬酸钾120g∶浓硫酸200ml∶蒸馏水1 000ml）浸泡12h，然后从酸缸中捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3～5次和用双蒸水过3次。

（5）烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。

（6）高压消毒20～30min，烘干。

2．旧玻璃器皿的清洗消毒

（1）刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏水溶液或洗涤剂溶液中，泡过来苏水溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。

（2）泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12h后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后黏附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。

（3）烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。

（4）高压消毒20～30min，烘干备用。

（二）金属器械洗消

金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75%乙醇擦拭，再用自来水、蒸馏水冲洗，烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好高压消毒30min，烘干备用。

（三）橡胶和塑料

橡胶和塑料制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序。

1．针式滤器帽不能泡酸液，用NaOH泡6～12h或者煮沸20min，在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上（凹向上），然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中再高压消毒30min，烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。

2．胶塞烘干后用2%NaOH溶液煮沸30min（用过的胶塞只要用沸水处理30min），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30min，用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

3．胶帽，离心管帽烘干后只能在2%NaOH溶液中浸泡6～12h，自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30min，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

4．胶头可用75%乙醇浸泡5min，然后紫外线照射后使用即可。

5．其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用75%乙醇浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。

为了防止清洗器材已消毒与未消毒发生混淆，可在纸包装后做好标记。

（四）注意事项

1．严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。

2．安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。

3．注意人体的防护和器皿的完全浸泡：①泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。②从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。③器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。

五、细胞培养用液的配制与消毒

（一）器材与试剂

干粉型培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、纯净水系统、电子天平、pH计、磁力搅拌器。

（二）水的制备

细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。

（三）PBS的制备与消毒（也可用于其他BSS，如Hanks、D－Hanks液的配制）

1．溶解定容：将药品（NaCl 8．0g，KCl 0．2g，Na₂HPO₄·H₂O 1．56g，KH2PO₄0．2g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1 000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。

2．移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内0．08MPa消毒20min。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水分。

（四）胰蛋白酶溶液的配制与灭菌

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8．0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。

1．称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0．25%，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调pH到7．2左右）或PBS（DHanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。

2．用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0．22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于－20℃保存以备使用。

（五）青、链霉素溶液的配制与消毒

1．所用纯净水（双蒸水）需要0．15MPa高压20min灭菌。

2．具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。

3．使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。

（六）RPMI 1640培养液的制备与消毒

1．溶解、调pH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中，并用双蒸水冲洗包装袋2～3次（冲洗液一并加入培养基中），充分搅拌至粉剂全部溶解，并按照包装说明添加一定的药品。然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0．5ml，使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调pH到7．2左右。最后定容至1 000ml，摇匀。

2．安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

3．抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

4．分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。

（七）HEPES溶液

HEPES的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N′－a－hydroxythylpiperazine－N′－ethanesulfonic acid）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10～50mmol/L，一般培养液内含20mmol/L HEPES即可达到缓冲能力。

1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPES 238．3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。

注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。如：称取4．766g HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。

（兰州大学　岳凤珍；复旦大学　刘晓宇）