第三节 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化
细菌质粒是一类双链共价闭合环状、大小为1～200kb的DNA，存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的可自主复制的遗传成分。通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒是目前最常用的基因克隆的载体分子之一，获得大量纯化的质粒DNA是基因克隆的前提条件。
一、碱裂解法提取质粒DNA的原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学性质不同。在pH12～12．5时，线性DNA会完全变性，而共价闭合环状DNA只是氢键断裂，经酸中和后，共价闭合环状DNA可迅速准确复性。而线性DNA不能准确复性，只能聚合成网状结构，离心后与变性的蛋白质、RNA一起沉淀下来。上清液中的质粒DNA可用乙醇沉淀出来。
二、基本步骤
1．材料：含质粒的大肠杆菌。
2．试剂：溶液Ⅰ［50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris－HCl（pH 8．0），10mmol/L EDTA（pH 8．0）］、溶液Ⅱ（0．2mol/L NaOH，1%SDS）用时临时配制。pH 4．8的醋酸钾（KAc）缓冲液（5mol/L KAc 300ml，冰醋酸57．5ml，加ddH2O至500ml）、TE缓冲液［10mmol/L Tris－HCl（pH 8．0），1mmol/L EDTA（pH 8．0）］、苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）、5×TBE（Tris碱54g，硼酸27．5g，EDTA－Na2·2H2O 4．65g，加ddH2O至1 000ml）。10mg/ml溴化乙锭（EB）、琼脂糖、10mg/ml RNase A（RNA酶A）、6×上样缓冲液［0．25%溴酚蓝，0．25%二甲苯腈蓝FF，40%（W/V）蔗糖水溶液］。
3．仪器：离心机、电泳仪、水平式电泳槽。
4．主要步骤
（1）挑取LB固体培养基上生长的大肠埃希菌单菌落，接种于2．0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
（2）取1．5ml培养物转移入微量离心管中，室温离心8 000g×1min，弃上清液，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
（3）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
（4）加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ于离心管中，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2～3min，使细胞膜充分裂解。
（5）加入150μl预冷的醋酸钾（KAc）缓冲液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3～5min。
（6）加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，振荡混匀，4℃离心12 000g×10min。
（7）小心移出上清液于另一微量离心管中，加入2．5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2～5min，4℃离心12 000g×15min。
（8）加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次，4℃离心8 000g×7min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干。
（9）沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，－20℃保存备用。
5．结果鉴定：1%琼脂糖凝胶电泳检测。方法同前核酸DNA的鉴定。
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