线粒体的提取

第四节　线粒体DNA的提取

线粒体DNA是染色体遗传物质，哺乳类动物的线粒体DNA为共价闭合环状的双链DNA。它变异快、结构相对简单，经母系遗传，对真核生物基因组的结构、复制、转录、调控机理等方面都起着重要作用。近年来被广泛用于近缘种间或种内种群间亲缘关系的研究。

线粒体DNA最早是用氯化铯梯度离心方法获得，该法提取的线粒体DNA纯度高，但所需仪器设备昂贵，实验周期长，限制其在群体遗传研究中的应用。继而出现了Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法等线粒体DNA的提取方法。

一、碱变性法线粒体DNA提取的原理

线粒体DNA的结构与质粒DNA的结构相似，均为共价闭合环状的双链DNA，实验原理与质粒DNA提取相同。

二、主要实验步骤

1．材料：新鲜小鼠肝组织。

2．仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、离心管、吸管。

3．试剂：50mmol/L葡萄糖、10mmol/L Na₂EDTA，25mmol/L Tris－HCl pH 8．0、1%SDS、0．2mol/L NaOH、3mol/L NaAc pH4．8、95%乙醇、75%乙醇、TE缓冲液。

4．主要步骤

（1）取50mg新鲜小鼠肝组织，加1ml冷匀浆液，用玻璃匀浆器匀浆，随即以1 000g×3min，4℃，离心，弃沉淀。

（2）取上清液，12 000g×10min，4℃，离心，沉淀即为粗线粒体。

（3）将沉淀溶于100ml（50mmol/L葡萄糖、10mmol/L Na₂EDTA，25mmol/L Tris－HCl pH8．0）溶液中，充分混匀。

（4）加200ml新鲜配制的（1%SDS，0．2mol/L NaOH）溶液，轻轻摇匀，冰浴5min。

（5）再加150ml（3mol/L NaAc pH4．8）溶液，轻轻摇匀，冰浴5min。12 000g×10min，4℃，离心。

（6）取上清液加等体积（酚、氯仿、异戊醇之体积比为25∶24∶1）溶液，抽提2～4次，界面无白色物质，10 000g×5min离心。

（7）取上清液加2倍体积95%乙醇，室温静置15min，然后12 000g×10min离心。

（8）弃上清液，沉淀用75%乙醇洗涤1次，以12 000g×5min离心。

（9）弃上清液，取沉淀，真空干燥后即得线粒体DNA。将其溶于适量的TE缓冲液中，－20℃保存。

5．实验结果鉴定：用紫外分光光度仪测定，A₂₆₀∶A₂₈₀为2．0左右。若纯度较高，能直接用限制性内切酶进行酶切图谱分析。

（上海中医药大学　王晓玲）