斑点杂交狭缝杂交技术

第四节　斑点杂交狭缝杂交技术

一、斑点杂交和狭线杂交的概念

Kafatos等人于1979年报道了将几种未经分离的核酸样品点样于固相支持物上，然后用特定探针与核酸杂交以检查靶核酸的存在的快速检测真核生物基因及其差异表达的RNA产物的技术，因所点样品扩散形状的不同，就有了斑点杂交和狭线杂交这两种名称。该技术简便、快速、灵敏，可迅速了解生物体某一基因在不同发育阶段的差异表达情况，以了解该基因在生物发育过程中的作用。但应用该技术对DNA或RNA的检测结果的稳定性较Southern杂交或Northern杂交稍差。

二、杂交的一般程序

获得粗提的或纯化的DNA或RNA（纯化的核酸实验重复效果好），采用真空加样法将核酸以斑点或狭线形式点样于尼龙膜而得到大小、形状、间距一致的样品点，以紫外交联、烘烤或微波照射将核酸固定于膜上，用特异性的探针与核酸杂交并检测靶核酸的存在。

三、杂交的实验步骤

（一）材料与设备

1．20×SSC。

2．RNA变性液：660μl 甲酰胺　　　　　　　　　210μl 37%（m/v）甲醛

　　　　　　　130μl 10×MOPS电泳缓冲液

3．预杂交液：0．5mol/L磷酸钠（pH 7．2）　　　7%（m/v）SDS

　　　　　　　1mmol/L EDTA（pH 7．0）

4．杂交液:0．25mol/L磷酸钠（pH 7．2）　　　　0．25mol/L NaCl

　　　　　7%（m/v）SDS　　　　　　　　　　　 50%甲酰胺

（二）实验步骤

1．依说明安装印记装置。

2．将溶于10μl水中的RNA样品与30μl的RNA变性液混合于微量离心管中，65℃温浴5min。

3．在冰盒中将温浴后的RNA与40μl的20×SSC混合；同时以10×SSC湿润尼龙膜。

4．以真空装置点样（约5μg RNA/次）于膜上并吸干膜。

5．在波长254nm的紫外线下照射5min以固定RNA于膜上。

6．加入杂交液68℃预杂交2h。

7．弃去预杂交液，把探针与68℃预热的杂交液混合，将膜浸入含有探针的杂交液中，68℃温浴16h。

8．取出杂交膜，放入含有0．1%SDS的1×SSC的塑料袋内并封口，于室温下轻摇10min。

9．取出杂交膜，放入预热到68℃的含有0．1%SDS的0．5×SSC的塑料袋内并封口，于68℃下轻摇10min。重复该步骤两次。

10．取出杂交膜，用滤纸吸干，依探针标记物（放射性或非放射性）的不同，选择对应的检测方法进行检测。

（三）注意事项

1．操作时，不能用手直接接触杂交膜，以免造成背景升高。

2．双链探针杂交前要变性。

3．操作过程中，避免膜干燥。

4．有必要的话，可做Southern或Northern杂交对照。

（山东中医药大学　李　兰）