姐妹染色单体技术

第三节　姐妹染色单体技术

姐妹染色单体交换（sister chromatial exchange，SCE）是染色体同源座位上复制产物间的相互交换，是同一染色体的两条单体之间发生的一类特殊的同源重组，主要在DNA合成期形成，可能与DNA双链的断裂与复制有关，SCE的发生的频率可反映细胞在S期的受损程度。如果一个个体的SCE率明显增高，可表明染色体受到环境中的一定因素的影响，或是受到遗传缺陷的内在制约因素所致。

一、姐妹染色单体互换概念

5－溴脱氧尿嘧啶核苷（5－bromodeoxy－uridine，BrdU）是脱氧胸腺嘧啶核苷的类似物，在DNA链的复制过程中，可替代胸腺嘧啶。在细胞培养过程中，加入一定的5－溴脱氧尿苷（BrdU），当细胞在DNA复制过程时，BrdU能作为核苷酸的前体取代胸腺嘧啶而被掺入到新合成的DNA中。因此，当细胞处于第二个分裂周期时，同一染色体的两条姐妹染色单体，一条由双股都含有BrdU的DNA链构成，而另一条为单股含有BrdU的DNA链。在结构上双股含BrdU的DNA螺旋化程度较低，故对染色剂亲和力低，在用Giemsa染色时其单体着色浅，只有单股含BrdU的DNA链组成的单体则着色深而形成差别着色。应用姐妹染色单体交换技术研究来自一个染色体的两条单体之间在同一个位点发生同源片段的交换，称为姐妹染色单体互换。当姐妹染色体间存在同源片段交换时，可根据每条单体夹杂着深浅不一的着色片段加以区分。由于姐妹染色单体的DNA序列相同，SCE并不改变遗传物质组成，但SCE是由于染色体发生断裂和重接而产生的，因此，SCE显示方法通常用来检测染色体断裂频率，用来研究药物和环境因素的致畸效应。

二、实验用品和材料

1．材料：人外周血（或培养细胞）。

2．器械：光学显微镜、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、20W紫外线灯、培养瓶、10ml刻度离心管、吸管、试管架、注射器（1ml、2ml）、酒精灯、载玻片、天平、小烧杯、染色缸、黑纸、擦镜纸。

3．试剂：RPMI 1640培养液、PHA、肝素、2×SSC、500μg/ml的BrdU、pH 6．8磷酸缓冲液、Giemsa染液。

4．试剂的配制

（1）500μg/ml BrdU：称取BrdU 4．2mg，加入8．4ml无菌生理盐水，摇匀后即成500μg/ml的BrdU溶液，4℃冰箱避光保存。

（2）2×SSC溶液：先配制A液（0．30mol/L氯化钠∶17．54g氯化钠溶解在蒸馏水中，定容至1 000ml）和B液（0．030mol/L柠檬酸钠∶8．82g柠檬酸钠溶解在蒸馏水中，定容至1 000ml）；使用时将A和B两溶液等体积混合即成2×SSC溶液。

（3）常规配制RPMI 1640培养液、Giemsa染液、肝素液。

三、实验方法与步骤

（一）细胞培养（人外周血淋巴细胞培养）

1．接种：无菌抽取外周全血0．2～0．3ml（肝素抗凝），接种在5ml含有PHA的RPMI 1640培养液中，37℃培养箱培养。

2．加BrdU：培养24h后加500μg/ml BrdU液0．1ml，终浓度为10μg/ml，混匀后，避光培养。

3．加秋水仙素：在收获细胞前2h加秋水仙素（终浓度为0．2μg/ml培养液）。

（二）收获细胞和制备染色体玻片

收获细胞及染色体标本制片均与人类染色体标本的制备相同。

（三）标本老化

将制好的染色体玻片置37℃培养箱2天或在60℃干烤箱烤片2h。

（四）差别染色———紫外线照射法

1．将老化好的染色体标本片放入一平皿中（最好用牙签放在玻片下面），在玻片上盖一张稍大些的擦镜纸，使纸的四边垂于平皿中，滴加2×SSC液到纸上，使擦镜纸全部润湿，使平皿中放入的2×SSC溶液与玻片水平，保证有充足的2×SSC液渗至标本上保持标本湿润。

2．将平皿置于56℃的水浴箱中，使平皿底部接触水面。

3．在水浴箱上架一支20W的紫外线灯，使灯管与标本的距离6cm左右，开灯照射30min。

4．照射完毕，用镊子轻轻揭去擦镜纸，用自来水轻轻冲洗玻片。

5．1∶10Giemsa染料染色8～10min（不要着色过深）．

6．自来水冲洗晾干后即成SCE标本。

四、注意事项

1．BrdU溶液最好现用现配，一次用不完，必须4℃避光保存。

2．BrdU是强的致突变剂，使用浓度不易太高，在每毫升含25mg左右的剂量下不影响细胞增殖。外周血培养24h后加入均可。

3．用紫外线照射诱发姐妹染色单体分化时，如紫外灯功率大，照射时间应相应减少。一般在20W的紫外灯距标本距离应在6cm左右；如果在15W紫外线灯照射时距离标本应在4cm左右。温度要控制在50～60℃（冬天最好是55～60℃），但不应超过60℃。如果时间过长或温度过高都易造成染色体肿胀。

五、预期实验结果及分析

（一）预期实验结果

在某些进入第二次复制中期的分裂象中，清晰可见姐妹染色单体分染为一深一浅图像，可观察到姐妹染色单体同源片段等位交换相。

（二）实验结果观察分析

1．选择在加入BrdU之后经过两个复制周期，姐妹染色单体分化着色清晰，染色体分散良好，长短合适和染色数目完整的中期分裂，进行观察分析。

2．SCE交换次数判定：染色体某臂端部交换算1次交换，臂间交换算2次；着丝粒处发生交换（需排除染色体在此发生扭曲）计一次。

3．每个标本分析30～50个中期分裂象。

4．SCE率计算：

SCE率＝累计互换数/观察细胞数＝SCE/细胞