第四节 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核检测
微核是游离于细胞质中的核物质小体，一般为主核的1/4～1/3。微核是染色体畸变的一种特殊表现形式，是细胞分裂后期滞留的染色体断片或整条染色体在子代细胞分裂间期的细胞质中形成的游离团块物。由于染色体受化学诱变剂和辐射损伤而断裂成一些无着丝粒的染色体断片或纺锤体受到某些毒物作用而损伤，当细胞进入分裂后期时，染色体不受纺锤丝牵引而滞留在赤道板附近。在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，由于比主核小得多，故称微核。微核同主核一样，是由DNA物质所组成。现已证实，微核率同外界作用因子的剂量呈线性正比关系。因此，微核检测技术已广泛应用在辐射防护、损伤，化学诱变剂研究和新药、保健食品的毒理实验中。
一、微核检测技术
微核的产生与染色体和DNA损伤有较大关系，常将微核的检出率作为DNA损伤的一种指标。
微核试验（micronucleus test，MNT）方法可分成两大类。一类是从外周血中分离淋巴细胞，常规涂片即可，称直接法。该法制作简便、快速，适用于大面积的人群普查，但检出率低，敏感性较差，在准确反映染色体损伤方面一直有质疑。另一类是培养法，即将细胞经体外培养后再制片，该法检出率高，敏感性较强，而且制备的标本胞浆完整、染色清晰。
微核的形成需要经过一次细胞分裂。有丝分裂阻断法微核检测技术是利用一定浓度的细胞松弛素B阻断淋巴细胞细胞质的分裂而不影响细胞核的分裂，即在淋巴细胞培养过程中加入细胞松弛素B，使经过一次分裂的淋巴细胞呈双核，选择这部分细胞进行微核计数而提高了实验的敏感性。同时也成为检测致突变、致癌、致畸物质对机体遗传效应的一种重要手段。
微核技术与其他技术结合，实验方法日趋完善，试验选择范围越来越广，如小鼠、大鼠、中国仓鼠、猕猴、豚鼠等，各种实验动物中，小鼠价格便宜，骨髓中干扰因素少，是微核试验的常用动物。
二、骨髓微核试验
环磷酰胺因具有显著的诱变作用，而常被用作骨髓微核试验的阳性对照物。除此之外，射线、顺铂等也常用作阳性对照物或诱导剂。
骨髓嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE）中主核已排出，微核经Giemsa染色后色泽鲜红，胞质内含有核糖体，被染成淡灰蓝色，微核与胞质形成鲜明的对比，易于鉴别；而成熟红细胞中的核糖体已溶解，被染成淡橘红色，与PCE区别明显。
三、实验用品和材料
（一）材料
2～3月龄、体重18～22g的健康小鼠。
（二）试剂
小牛血清（经灭活处理）、Giemsa原液、磷酸盐缓冲液（pH 6．8）、甲醇、环磷酰胺。
（三）器械
1ml注射器、解剖器械、低速离心机、5ml离心管、毛细吸管、载玻片、染色缸、显微镜、计数器。
四、实验方法与步骤
1．染毒：小鼠腹腔注射一定量的化学物质及环磷酰胺（40mg/kg体重）。
2．取材：以颈椎脱臼法处死小鼠，取两腿股骨，剔净肌肉，擦去附着在上面的血污，剪取两端股骨头，暴露骨髓腔，用注射器吸取1ml灭活小牛血清，将针头插入骨髓腔上段冲洗，用试管接收冲洗液，即成骨髓细胞悬液。
3．离心：1 000r/min离心5min，弃大部分上清液，留少许液体，用毛细吸管将细胞团块轻轻吹打均匀。
4．涂片：混匀后的液体滴1滴于载玻片上，血常规涂片法涂片，自然干燥。
5．固定：玻片标本置于甲醇溶液中固定5～10min，晾干。
6．染色：Giemsa原液用磷酸缓冲液按1∶9的比例稀释，染色10min。自来水轻轻冲去多余染液，晾干，镜检。
7．观察：油镜下观察嗜多染红细胞的微核。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，偶尔呈肾形、马蹄形或环形，嗜色性与主核一致，直径通常为红细胞的1/20～1/5。每张玻片标本计数100～200个嗜多染红细胞，按“‰”计算微核的出现率，微核计数以“细胞”为单位，即1个细胞中出现2个或2个以上微核时，只按“1”计算。
五、注意事项
1．小鼠股骨较短、细，剪股骨头时，应尽量保持股骨中段的完整。
2．染液浓度、pH、染色时间等多种因素均可影响染色效果，例如微核可被染成鲜红色、蓝紫色或紫红色，甚至同一张标本上也会出现染色深浅不一致的现象，因此，计数前必须仔细观察PCE和成熟红细胞的差别，正确辨认。
3．室温较低时，可适当延长染色时间。
4．正确掌握微核的形态特征，避免假阳性。PCE中的RNA颗粒、含酸性多糖的颗粒以及一些附着的染料颗粒等经Giemsa染色后与微核颜色一致，易与微核混淆，应注意辨别。在实际应用中，如有必要，可采用其他方法重复试验，以排除假阳性。
5．制片后，以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。
六、预期实验结果及分析
（一）实验结果为阳性
给药组与对照组微核率有明显的剂量反应关系并有显著性差异（P＜0．01）时，可认为是阳性试验结果。这说明该化学物质能引起染色体断裂，是一种DNA断裂剂，但要排除假阳性。若统计学上有显著性差别，但无剂量反应关系时，则需进行重复试验，结果能重复者可确定为阳性。
（二）实验结果为阴性
实验结果为阴性时，下结论要十分慎重。出现阴性结果的主要原因有以下几点。
1．被筛选的化学物质不引起微核率增高。
2．制片时间不当：有些断裂剂能延迟红细胞的分裂和成熟，使出现微核的高峰时间推迟，因此，应根据细胞周期和不同物质的作用特点，确定取材时间。可先做预试验，一般为30h。
3．剂量过高或过低：各种化学物质的理化性质、体内代谢途径不同，应根据实验需要，根据药物的特点选择给药途径。例如，骨髓实验需短时间内达到有效浓度，应选用腹腔注射或口服用药。
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