荧光原位杂交

第五节　荧光原位杂交

原位杂交（in situ hybridization，ISH）是一种在维持组织、细胞或染色体固有形态结构的基础上对其内部核苷酸序列进行特异检测及定位的分子生物学手段。ISH的原理是将特殊标记或修饰的核苷酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中的DNA或RNA杂交，并通过分析探针在被检对象中的显示状况，以完成目的核苷酸序列检测或定位。

早期的ISH技术是以放射性同位素标记探针和放射自显影技术为基本手段。由于放射性同位素标记法具有一定的危险性以及操作繁琐，而逐渐被荧光法、酶沉淀法或发色团检测等方法所取代。荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术即是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。

FISH技术的优点在于：①探针稳定、操作安全、快速、特异性高；②多色FISH可以在同一核中显示不同的颜色，从而同时检测两种或多种序列。目前已可用5种荧光素显示23种颜色来代表23对染色体，从而使核型分析直观简单；③FISH也可用于间期细胞核内DNA的三维结构的显示；④反向染色体涂染可以准确、客观地辨别新生染色体的来源；⑤微矩阵（microarray）技术和组织矩阵（tissue array）技术使得一次性检测几百个基因或几百个组织成为可能；加快了检测的速度。

一、FISH常见类型

1．原位杂交显带技术：为了准确定位原位杂交部位所处染色体及其区带，染色体必须显带，但杂交与显带过程会相互影响效果。在人类短重复序列中存在Alu家族，片段长约300bp，在基因组中重复约9 000 000次。Alu－PCR法是以Alu序列作为引物扩增Alu间的DNA；由于Alu序列在基因组中分布不均，只有在致密区可以扩增出产物。以产物制备探针，通过杂交可以在染色体上形成类似R带的荧光带型。以不同的荧光物质标记目的探针与Alu－PCR探针，将可在染色体上同时显示杂交信号和染色体带型，这种荧光原位杂交技术称为原位杂交显带技术（in situ hybridization banding，ISHB）。

2．染色体原位抑制杂交：在染色体文库探针、cosmid和YAC探针中，常存在许多重复序列家族如Alu、Kpnl等，它们将干扰探针识别靶顺序的特异性。将经过超声破碎制备而成的500bp左右的人类总DNA（THDNA）片段，以一定比例与探针混合、变性。变性后，在37℃孵育而完成THDNA与探针中重复序列之间的退火，此后再与染色体杂交，实现与靶序列之间的特异结合，称为染色体原位抑制杂交（chromosome in situ suppression，CISS）。

3．多色荧光原位杂交：利用不同颜色的荧光素标记不同的探针，同时对一张制片进行杂交，从而对不同的靶DNA同时进行定位和分析，并能对不同探针在染色体上的位置进行排序，形成多色FISH（mFISH）。包括组合标记FISH、比例标记FISH，以及多色染色体涂色等。组合标记FISH（combinatorial FISH）利用几种不同颜色的半抗原或荧光素同时标记一个探针，组合标记原则上可标记的探针数为2n－1（n为半抗原或荧光素的个数）；比例标记FISH（ratio labelling FISH）应用不同比例的各种荧光素标记每个探针，并进行组合标记FISH，可以完成定量分析；多色染色体涂色（multicolor chromosome painting）是利用组合标记FISH或比例标记FISH对染色体、染色体臂或染色体带特异性涂色探针进行标记而进行的mFISH。

4．比较基因组原位杂交（comparative genomic hybridization，CGH）是一种改进的FISH，通过对待检测的DNA（如肿瘤细胞DNA）和相应的正常细胞DNA进行不同颜色的标记（如肿瘤细胞DNA标记为红色，正常细胞DNA标记为绿色），同时与正常细胞的中期染色体进行杂交，然后根据两种探针荧光信号的强度差异判断待测与对照基因组DNA序列的拷贝数之比，找出待测基因组中的DNA扩增和缺失等变异（进行结果判断），并描绘出相应的CGH核型图。

5．DNA纤维FISH（DNA fiber FISH）是一种应用各种不同的方法将细胞中的DNA在载玻片上制备出DNA纤维，用不同颜色荧光物质的探针与之杂交，并在荧光显微镜下观察结果以及进行分析的技术。与其他FISH相比，DNA纤维FISH主要有如下优点：①高分辨率和定量分析，分辨率可达1～500kb；②模板要求不高，各种方式制备的线性DNA分子均可使用；③DNA需要量较少；④灵敏度高，可达200bp。但也存在一些固有的缺点：①DNA纤维的随机断裂可能导致同一探针的信号长度不一致；②DNA纤维伸展的程度不一，导致不同荧光相互干扰，影响定量分析；③从纤维FISH的结果不能判断探针究竟具体位于哪条染色体上；④以同源的串联重复DNA序列为探针，杂交后在DNA纤维上散在分布的重复序列会产生杂交的信号不连续等。

DNA纤维FISH在遗传学上具有广泛的应用，其不仅应用于精确作图和辅助基因克隆，而且也可定量分析不同克隆之间的排列顺序及重叠程度；定量检测染色体重排和缺失等异常；分析靶序列的拷贝数；决定基因之间的物理距离及其5′→3′定向；测量DNA座位的长度等。

二、FISH的一般程序

1．样本制备：用于FISH的样本可以来自于常规的血涂片、常规方法制备染色体玻片以及石蜡或冷冻切片等。为降低本底，杂交前可用RNA酶和蛋白酶K消化处理标本，然后再将玻片在70%甲酰胺中热处理一定时间，使DNA变性，然后于冷无水乙醇中退火，风干备用。

2．探针：FISH探针包括双链DNA、单链DNA、RNA和合成的寡聚核苷酸探针。DNA探针可分为4类：①基因组探针，多用于区分种间染色体或染色体区域的基因组DNA序列；②重复顺序探针，其目标顺序通常是染色体上不同部位的串联高度重复顺序；能够在某一条染色体的着丝粒区或异染色质区产生致密的杂交带；③染色体文库探针（又称涂染探针），通常是用流式细胞仪从染色体悬液中分离出染色体，或对分带中期染色体进行不同程度的微切割（microdissection），再经分子克隆或PCR扩增制备染色体特异性探针，主要针对染色体或染色体特异区进行杂交，用于检测分裂细胞中的染色体结构畸变和标记染色体；④单一序列探针，其片段一般比较长，必须插入到黏粒、噬菌体或酵母人工染色体（YAC）中进行扩增，主要用于单拷贝基因家族的检测定位。

探针标记分为直接标记和间接标记。直接标记就是将荧光素直接与探针相连。间接标记法是先在探针上接一半抗原，再用能同半抗原特异结合的带荧光标记的蛋白对其进行检测。标记方法多用缺口平移、随机引物标记和PCR扩增法。

3．杂交：把变性后的探针加到处理后的玻片上，37℃杂交16～20h，杂交完成后必须将游离的探针充分洗去。晾干后加适量的抗褪色液。

4．检测和显色：检测方法包括直接荧光法和间接免疫荧光法。如用荧光染料直接标记探针，可直接置于荧光显微镜下观察；若探针是用一个半抗原标记的，则可通过间接免疫荧光法进行检测。用生物素标记的探针经常用FITC（绿荧光）、得克萨斯红或罗丹明（红荧光）标记的亲和素来显色观察；也可通过生物素化抗亲和素抗体夹层逐级放大信号进行检测，玻片还常用碘化丙锭（propidiumiodide，PI）补染，以便在荧光显微镜下观察杂交信号的同时，能看到胞核及染色体结构。

三、FISH的应用

（一）在细胞遗传学中的应用

常规的染色体研究方法对于小片段易位、倒位、重复和缺失难以分析。FISH技术不仅可以应用染色体涂色方法检测间期细胞靶染色体数目变化，而且可以确定易位、重复、缺失或插入等染色体重排类型，为畸变染色体来源和断裂点提供可靠依据，并可鉴定环状染色体、双随体双着丝粒额外小染色体以及其他标记染色体。目前，FISH技术现已广泛应用于X、Y、21、13和18染色体数目畸变的临床诊断。

（二）在基因定位和基因制图中的应用

FISH不仅可以以目的基因为探针，对中期的染色体进行杂交，确定该基因在染色体上的位置；而且可以用于动植物基因组结构的研究和DNA分子物理图谱的构建。FISH的分辨率决定了DNA分子图谱的准确性和精密程度。以中期染色体为DNA载体建立起来的分子图谱称为染色体分子图谱。由于中期染色体经过复杂的折叠过程，将导致两个荧光探针间的分辨率保持在1～3Mb之间。应用细胞同步化技术制备的前期染色体可以将FISH的分辨率提高到175kb。DNA纤维FISH可以进一步将分辨率提高到1kb，并与常规分子生物学的限制性内切酶图谱相近，但它具有更快速、更直接、更简便的优点。高分辨率的DNA荧光原位杂交技术能够快速准确地得到探针序列间的顺序、方向和真实的物理距离。

（三）在基因诊断中的应用

FISH技术是人类疾病临床诊断的重要手段之一。现有的高分辨分析方法不能检测诸如Duchenne/Becker肌营养不良、Prader－Willi综合征等存在微小染色体缺失的人类遗传病。FISH技术可以通过探针杂交，直观地观察到正常染色体存在杂交信号，而存在缺失的染色体无杂交信号，从而诊断缺失的存在与否。在血液病的研究中，特异的融合基因探针可以快速检测致病基因的存在，例如以ABL和BCR融合基因的cosmid克隆制备的FISH探针可以筛选Ph＋病人；Y特异性DNA探针可以有效地诊断SRY基因等。

四、染色体标本的FISH技术

（一）实验原理

FISH是以分子杂交为基础，应用非放射性荧光物质标记核酸探针，通过碱基互补的原理与靶DNA杂交，在核中或染色体上显示靶DNA序列位置的方法。FISH技术可分为4个步骤：样品制备、探针标记、杂交及其检测。

（二）实验用品和材料

1．材料：染色体标本或血涂片。

2．试剂：甲醇、乙醇、乙酸、标记探针（生物素标记探针或地高辛标记探针）、3mol/L乙酸钠、甲酰胺（分子生物学级和粗制品）、杂交缓冲液（4×SSC，20%硫酸葡萄糖）、鲑精DNA、磷酸钠、Tween20、BSA、检测液（5μg/ml荧光素偶联的亲和素或6μg/ml罗丹明偶联的抗地高辛抗体）DAPI。

3．仪器：低温高速离心机、荧光显微镜、漩涡混匀器、移液器、恒温水浴锅、培养箱、烤箱。

（三）实验方法与步骤

1．探针混合与变性

（1）混合20～60ng标记探针DNA和3～5μg鲑精DNA。反应后体积少于10μl，可直接冻干；若体积较大，可加1/20体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积100%乙醇沉淀DNA。混匀并于－70℃30min。在4℃，12 000r/min离心10min，弃上清液，沉淀物以300μl 70%乙醇洗涤后在离心（同上），弃上清液，冻干。

（2）将DNA重悬于5μl去离子的甲酰胺中，室温漩涡混匀3min。

（3）加入5μl杂交缓冲液，漩涡混匀5min。

（4）将DNA探针置于75℃水浴中变性5min。迅速置于冰浴中5min，备用。

2．样本处理

（1）染色体制备标本或血涂片在室温下依次用70%、90%、100%的乙醇脱水，各5min。晾干备用。

（2）变性前将载玻片置60℃烤箱内孵育，目的是防止变性液加至载玻片时温度降低。

（3）将变性液在水浴箱中加热至70℃。

（4）将预热的载玻片移至含变性液（70%去离子甲酰胺、2×SSC和50mmol/L磷酸钠）的Coplin广口瓶内2min。

（5）立即将载玻片依次移入70%、90%和100%预冷的乙醇中，各5min。防止DNA复性。

（6）空气干燥。

3．杂交

（1）将10μl含变性探针的杂交混合液加至载玻片上变性的靶DNA上。

（2）在杂交液上盖上盖玻片，防止产生气泡。

（3）用橡胶泥将盖玻片四周封好，并置湿盒内37℃温浴过夜。

4．检测

（1）从湿盒内取出载玻片，除去橡胶泥。

（2）将载玻片置于42℃预温的漂洗液A（50%甲酰胺，2×SSC）中，在恒温水浴摇床中振荡10min，并使盖玻片脱落。更换漂洗液A两次，每次振荡5min。

（3）将载玻片移入60℃预温的漂洗液B（1×SSC～0．1×SSC，pH 7．0，根据实验需要调整。），漂洗5min，更换漂洗液B两次，每次5min。

（4）将载玻片取出，甩尽液体，加200μl封闭液（3%BSA，4×SSC，0．1% Tween20），盖上盖玻片，防止气泡产生，置于湿盒内，37℃温浴30min以上。

（5）移去盖玻片，除去多余液体，加200μl检测液（5μg/ml荧光素偶联的亲和素或6μg/ml罗丹明偶联的抗地高辛抗体，缓冲液为1%BSA、4×SSC和0．1Tween20），在37℃湿盒内温浴30min。

（6）移去盖玻片，将载玻片置于漂洗液C（4×SSC，0．1%Tween20，pH 7．0）中，42℃振荡漂洗3次，各5min。

（7）将载玻片置于复染液（2×SSC，200ng/ml DAPI）中，室温振荡20min。

（8）载玻片在漂洗液D（2×SSC，0．05%Tween20）中室温温育1～2min。

（9）荧光显微镜下观察。

（四）注意事项

1．在探针的混合和变性中，杂交液甲酰胺浓度必须根据DNA探针的特点进行调整。提高甲酰胺浓度可以增加重复DNA探针杂交的特异信号。

2．变性时间。当变性不够充分时，杂交反应不能有效进行；变性过分，将引起染色体DAPI复染模糊不清，使染色体形态丧失。

3．在检测的过程中，必须保持载玻片的湿润。

4．从荧光素标记到制片结束，整个过程须在避光下完成。避免由于光照，导致荧光淬灭。

（牡丹江医学院　宋　洁　卜晓波）