细胞生物学综合实验

第十二章　细胞生物学综合实验

包括人类在内的生物体都是由细胞组成的，细胞是生命的基本单位。正常生物体内细胞的诞生和死亡多处于一个动态平衡状态，如果这种平衡被破坏，生物个体将会患病。以人为例，如果该死亡的细胞没有死亡，就可能导致细胞恶性增长，形成肿瘤。如果不该死亡的细胞过多地死亡，比如受艾滋病病毒的攻击，不该死亡的淋巴细胞大批死亡，就会破坏人体的免疫能力，导致艾滋病发作。目前，人类对于疾病的治疗也从先前的对症治疗转向对因治疗，因而很多治疗往往以细胞为靶点。对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。

体外培养的细胞是细胞生物学和分子生物学研究的一个常用材料。无论是细胞系还是原代培养细胞均具备容易操作、易于观察等特点，而且又在一定程度上保存着与体内细胞相同的基本结构和功能，因而常被用来建立多种细胞损伤（UV射线、缺血、药物或某些化学物质等）或细胞保护模型（蛋白质的上调或下调表达，药物等）。随后通过多项研究进行从现象的观察到机制的探讨，为各种生理病理现象乃至临床治疗提供一定的理论基础。

脑缺血是人体内常见的会导致严重后果的病理状态，缺血神经元损伤的机制日益受到人们的关注，人们也在寻找更好的保护神经元的方法。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（rat adrenal pheochromocytoma，PC12）细胞是最常用的神经细胞模型。缺糖（glucose deprivation，GD）是缺血过程中关键因素，因此本实验旨在通过检测缺糖对细胞的影响，以及缺糖损伤保护性药物谷氨酰胺对细胞的保护作用，从而为类似的研究提供一定的范例。

选用PC12细胞进行相关研究，分为正常组（正常培养）、损伤组（缺糖培养）、保护组（缺糖培养的同时进行谷氨酰胺处理），并选择合适的时间点（GD 3h，6h，12h，24h等）进行相关指标的检测。其中，正常组是指正常培养条件下的PC12细胞；损伤组是给予PC12细胞缺糖培养，培养至相应的时间点；保护组是指在PC12细胞缺糖培养的同时给予缺糖损伤保护性药物谷氨酰胺处理。在相同的时间点首先观察了缺糖对PC12细胞的损伤以及谷氨酰胺对细胞的保护作用，主要进行了形态学观察以及细胞活力等检测；随后对观察到的现象做进一步的机制探讨。

已有的研究表明，缺糖可引起细胞凋亡，而谷氨酰胺可以抑制细胞的凋亡。因而，预期观察到的现象应该是在相同的缺糖时间点，损伤组细胞活力明显低于保护组和正常组；细胞凋亡率明显高于保护组和正常组。细胞在多种应激作用下往往会启动内源性凋亡通路，引发随后的细胞死亡。细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）和其他促凋亡因子从线粒体向胞浆的释放是内源性凋亡通路中关键的控制因素。Bcl－2家族成员是调节内源性凋亡通路的线粒体上游分子，可以通过控制Cyt C的释放影响凋亡的进程。Bax是Bcl－2蛋白家族中的一个促凋亡蛋白，其表达增加或构象改变后易位到线粒体，促进了线粒体外膜的通透性转换孔的形成和开放，从而释放出Cyt C和凋亡诱导因子，激活内源性细胞凋亡途径。为此进一步探讨了缺糖诱导细胞凋亡以及谷氨酰胺抑制缺糖诱导细胞凋亡的机制，主要检测了Cyt C的释放以及Bax表达和构象改变。已有的研究还表明，多个信号通路（Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/AKT通路等）的活化可以作用于Bcl－2家族成员Bax从而调控细胞凋亡，因而可通过特异性的通路抑制剂和WB技术探讨多个信号通路与缺糖诱导细胞凋亡及谷氨酰胺细胞保护过程中的关系。

技术路线图见图12－1。

图12－1　细胞损伤及保护相关的技术路线图

据此，设计一个关于细胞损伤与保护研究的具体方案，并绘制其他细胞损伤和保护的技术路线图。

（复旦大学　杨　玲）