脂质体的分离与灭菌

第一节　脂质体的分离与灭菌

一、脂质体与未包封药物的分离

适当化学结构的亲脂性药物是镶嵌在双层膜内而被包裹在脂质体中，其包封率取决于所用脂质的浓度。在这种情况下，包封率可达到90%，就不一定要除去未包裹药物。但是对水溶性药物而言，被包裹的药物仅是总量中的一部分，就必须从脂质体悬液中除去未包裹药物。由于脂质体比被包裹的药物分子要大得多，因此可利用它们的不同大小来分离除去未包裹的药物，这些方法有凝胶过滤柱层析法，渗析法等;若被包裹的物质是蛋白质或DNA，或者未被包裹的药物可能形成较大的聚结物，则可利用它们与脂质体浮力、密度的不同而采用诸如离心等方法进行分离。

1．透析法

此法是最简单的也是最常用的除去未包裹药物的方法(大分子化合物除外)。它不需要复杂的技术，也无须昂贵的仪器，且能够扩大生产。通过不断改换透析介质可除去所有的游离药物。但是此法很费时，一般在室温条件下，要除去95%以上的游离药物至少需要更换三次渗析介质，时间在10～24 h以上。此外，透析介质的渗透强度应与脂质体悬液一致，否则在透析中就会改变脂质体悬液的体积，且可能引起包裹物质的渗漏。

2．柱层析法

凝胶渗透层析技术广泛用于从脂质体悬液中分离除去未包裹药物，也可用于对悬液中的脂质体大小分组，这一技术在实验室中很有效且快速。在大规模生产上，虽然也可用凝胶过滤来纯化，但技术较困难且价格昂贵。另外，脂质体被洗脱介质稀释后可能需要增加浓缩步骤。

柱层析填料常用葡聚糖如Sephadex G－50，其步骤与常规方法一致。但必须指出:①在葡聚糖表面存在着能与脂质体膜结合并相互作用的微小部位。虽然这种作用并不影响脂质体在凝胶柱上的流动特征，但仍可导致少量脂质的损失，使膜的不稳定性增加，从而导致膜渗透性的改变及包裹物质的渗漏。这种现象在脂质浓度较低的情况下特别应予注意，一般可通过加大脂质体样品上柱量或用空脂质体预先将柱子饱和来解决。通常使用20 mg脂质制成的小单层脂质体可饱和10 g凝胶;②若凝胶颗粒太细，较大的脂质体可能被滞留在凝胶柱上，因此对多层脂质体宜选用中粗级的凝胶(粒径大小为50～150μm)，而对小单层脂质体则可用任何级别的凝胶。

柱过滤本质上是在溶剂贮库与出口之间的单位重力或流体静压差作用下的渗滤。Sephadex G－50或G－100最为常用，但也可用Sepharose 2B－6B或Sephacryl S200－S1000。脂质体不进入柱填料颗粒的孔内，而是渗漉通过颗粒间的空隙。流速缓慢且样品体积适当时，脂质体与小分子物质(包括表面活性剂单体)的分离效果很好。脂质体从空容积中洗脱出来。如果首次使用以恰当缓冲液溶胀并具有一定程度交联的多糖颗粒填充柱，必须进行预处理。令人惊奇的是，新溶胀多糖颗粒吸附大量的两亲性脂质。当以头基标记14 C的卵磷脂制得的脂质体通过Sephadex G－50或Sepahrose 2B柱时，在流出液中仅能检测到柱顶端上样样品每分钟计数( cpm)的20%～30%。这种高度的脂质吸附性损失(未发表的数据)表明，定量时需要用空白脂质体进行预处理。如果用空白脂质体混悬液对柱进行脂质预饱和，柱过滤法就可用来分离脂质体与未被包封的低分子质量化合物(如药物、细胞因子、酶抑制剂、底物等)或分离蛋白脂质体与残留的游离蛋白质以及分离混合胶束与单分子表面活性剂。

3．离心法和鱼精蛋白凝聚法

在不同的离心力下离心是分离除去不同种类脂质体中游离药物的有效方法。为了完全除去游离药物，常常需重复悬浮和多次离心。使脂质体下沉所需的离心力取决于脂质体的大小，在某种程度上还取决于混悬液的絮凝状态。如果脂质体小且分布窄，就需要高速离心及冰冻条件。低速(2000～4000 r/min)离心只能使大脂质体沉降。

显然，对于大量脂质体利用高速冰冻离心是极其耗能和昂贵的，因此此法不适于分离小脂质体。对于比较大的脂质体，低速离心可缩短操作时间并且可同时将较稀的脂质体悬液浓缩到所需浓度。为了避免脂质体遭到破坏，必须注意保证重复混悬介质的渗透压与脂质体悬液的渗透压相一致。

鱼精蛋白凝聚法(protamine aggregation)可用于任何组成的脂质体，如中性或带负电荷的脂质体，需进行预实验，检验被脂质体包封的物质从脂质体中释放后不因鱼精蛋白的存在而发生沉淀(图4－1)。方法如下:取0．1 mL脂质体悬液于10 mL锥形离心管中，加入0．1 mL鱼精蛋白溶液(10 mg/mL)，搅匀，静置3 min，再加3 mL生理盐水，在室温条件下离心，吸取2 mL上清液，测定游离药物的浓度。将剩余上清液弃去，沉淀物以0．6 mL 10% Triton X－100重新混悬，使脂质体膜材溶解，再补充生理盐水至总体积为3．2 mL，测定包封药物的浓度，就可方便地计算出包封率。

图4－1　鱼精蛋白凝聚法测定脂质体药物包封率

4．微型柱离心法

对于长期贮存、血液稳定性研究及质量分析等常用少量样本进行研究，因此，必须选用简单、快速分离未包封物质的方法。微型柱离心法分离非包裹药物快速有效，适用于分子量小于7000 Da的药物。

方法如下:取一塑料注射针筒，填上过滤膜作衬片，装入用生理盐水溶胀的Sephadex G－50，再将针筒置一离心管中低速离心(2000 r/min，3 min)除去多余的生理盐水，此时，凝胶柱变干并可能与针筒内壁分离，精确定量加入脂质体样品，注意勿滴入柱床边缘，离心(2000 r/min，3 min)使脂质体进入离心管中，待测。再在凝胶柱上加入少量生理盐水，依上法离心，此次离心液中可能不再有脂质体或仍含有少量，这主要取决于脂质体的大小及组成，但游离药物在此过程中因葡聚糖吸附而不会被离出，然后可在凝胶柱上再加生理盐水，离心使柱干，此时游离药物被洗脱进入离心液中，反复几次，直至全部游离药物均从柱子上离心洗脱下来，分别测定包封药物及游离药物浓度，就可计算出包封率。

微型柱离心法的优点是脂质体悬液几乎没有被稀释，对于实验室小规模的试验，可较好地用来分离除去未包裹药物和快速地测定包封率。

二、脂质体的灭菌

常用的脂质体灭菌方法如下:

1．热压灭菌

这种方法适合于少数脂质体药物，但在121℃可以造成脂质体不可恢复的破坏。不同脂质成分的MLVs和挤压脂质体，经121℃灭菌20 min后，在生理盐水中可以看到囊泡聚集，继而出现相分离，而在等渗溶液糖中未观察到聚集。加热灭菌后，具有较高的过氧化物值的含蛋卵磷脂的分散液稍变黄，改用具低过氧化物值的蛋卵磷脂、氧化蛋卵磷脂或DPPC则无此变化。在中性pH时充入氮气也可阻止颜色变化，但加入α－生育酚无效。经0．4μm膜过滤的由蛋卵磷脂组成的脂质体的大小变小。在这一变化中，介质的类型也有明显影响。加热灭菌期间，包裹有羧基荧光素阴离子的负电荷脂质体( PC/chol/PG)发生渗漏，而使用正电荷脂质体(PC/chol/十八胺)不仅在加热灭菌期间不发生渗漏，且可贮存很长时间不渗漏。

2．滤过灭菌

这是脂质体最常用的方法。0．22μm或更小的脂质体可通过该方法除菌，脂质体及其内容物损失0．3～18．6%。将脂质体挤压通过0．22μm聚碳酸酯膜也可以得到无菌的脂质体，这样可将调节粒径和除菌相结合，一步完成。

3．⁶⁰ Co射线灭菌

目前这种方法尚未广泛用于制药工业，⁶⁰ Co射线灭菌对脂质体灭菌可能是较好的选择之一，但也有研究表明，γ射线可破坏脂质体膜。

4．无菌操作

这是实验室制备无菌脂质体最常用的方法。将脂质体的组成成分脂质、缓冲液、药物和水分别先通过过滤除菌和热压灭菌。所用的容器及制备仪器均经过灭菌，在无菌环境下制备脂质体。这个过程费力、耗时并且花费大。